拮抗剂方案中hCG日孕酮水平对胚胎质量及妊娠结局的影响

2020-10-31殷慧群曹振毅姜宏

实用医学杂志 2020年19期

殷慧群曹振毅姜宏

1安徽省第二人民医院生殖医学中心（合肥230041）；2第901 医院生殖医学中心（合肥230032）

近年来，体外受精促排卵过程中hCG日孕酮（progesterone，P）水平升高对胚胎质量和妊娠结局的影响逐渐引起大家关注。不论是自然周期，还是促排卵周期，血清P 水平升高并不是一起偶发事件，可占促排卵周期的13%～46%［1］；而且与促排卵方案无关［2］。有研究［3-4］发现，hCG日血清P水平升高可引起胚胎-子宫内膜不同步，导致胚胎植入失败，与新鲜移植周期妊娠率降低有关。然而，血清P 水平对妊娠结局的影响仍然存在争议，其主要原因在于P 水平升高阈值的界定不一致，变化范围为0.4～3.0 ng/mL［5］。其次，P 水平升高对胚胎质量是否存在不利影响，目前还没有统一观点［6-7］。HILL 等［5］利用统计学方法综合临床结局和花费成本两方面研究发现，hCG日血清P 阈值设定在1.5～2.0 ng/mL 时比较合适，高于此值，一小部分患者可能面临新鲜移植失败风险，如果实施全胚冷冻，将会是一种更具经济效益的选择。此外，目前关于拮抗剂方案促排卵过程中血清P 水平对胚胎质量和临床妊娠结局影响的研究较少。因此，本研究拟设定hCG日血清P 阈值为1.5 ng/mL，比较拮抗剂方案中P＜1.5 ng/mL 新鲜移植周期与P≥1.5 ng/mL 全胚冷冻周期首次解冻移植后妊娠结局差异，以及获卵数和胚胎质量差异；其次，根据P 水平将P≥1.5 ng/mL 全胚冷冻周期组分成三个亚组，比较各组间妊娠结局、获卵数和胚胎质量差异；最后，当1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 时，比较新鲜移植周期和全胚冷冻周期首次解冻后妊娠结局差异；旨在为临床医生选择更具经济效益的移植时机提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性分析2016年1月至2019年10月在第901 医院生殖中心行IVF/ICSI 助孕的1 159 例患者资料。根据hCG日P 水平及是否新鲜周期移植将患者分为三组：A 组：hCG日P＜1.5 ng/mL 且新鲜周期移植，共897 周期。B 组：hCG日P≥1.5 ng/mL，行全胚冷冻，共199 周期。其中196周期行解冻周期移植；再根据P 水平，将其分为三个亚组：B1，1.5 ≤P＜2.0 ng/mL（37 周期）；B2，2.0 ≤P＜3.0 ng/mL（128 周期）；B3，P≥3.0 ng/mL（34 周期）。C 组：hCG日1.5 ≤P＜2.0 ng/mL，行新鲜周期移植，共63 周期。比较不同组间促排卵、胚胎发育及妊娠结局。

患者纳入标准为：（1）年龄＜38 岁；（2）促排卵方案为拮抗剂方案；（3）曾行IVF/ICSI 助孕次数＜3 次；（4）第3 天（D3）至少有一枚可利用胚胎。排除标准为：（1）卵巢低反应；（2）行补救ICSI 周期；（3）宫腔积液、子宫内膜异位症、纵隔子宫和双子宫等；（4）患者夫妇染色体核型异常；（5）有辅助生殖禁忌证者。

1.2 方法

1.2.1 控制性促排卵采用灵活拮抗剂方案［8］，即从月经周期第2～3 天给予促性腺激素（Gn）促排卵，4～5 d后根据卵泡大小及激素水平添加促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-A），当3 个卵泡直径≥17 mm 或2 个卵泡直径≥18 mm 时，注射hCG 5 000 U，36 h 取卵。D3 或D5 行胚胎移植或冷冻，移植后常规黄体支持。

1.2.2 体外受精、胚胎培养、评分及冷冻取卵日超声引导下行经阴道卵泡穿刺术，分拣出卵冠丘复合物，成熟培养3～4 h，根据优化处理后精液参数行常规IVF 或ICSI 受精，然后常规序贯微滴培养。D1 观察原核，见1～2 个原核或双极体见卵裂者均视为正常受精，≥3 个原核视为多精受精。D3 卵裂速度正常，卵裂球大小较均匀，细胞数为7～10 且碎片＜25%的胚胎视为优质胚胎。细胞数为≥6 且碎片＜50%的胚胎视为可利用胚胎。正常受精D3 细胞数≥4 且碎片＜50%胚胎继续培养至第5～7 天。根据GARDNER［9］分级对囊胚进行评分，≥2 期囊胚纳入形成囊胚数计算，≥3 期且内细胞团和滋养层评分不同时含C 级囊胚视为可利用囊胚。胚胎行玻璃化冷冻，囊胚冷冻前常规激光辅助皱缩。

1.2.3 解冻周期包括自然周期和激素替代周期准备子宫内膜。按照玻璃化解冻程序解冻胚胎，培养2 h 后移植，囊胚解冻后即刻激光辅助消除1/4周长透明带。

1.2.4 妊娠判断胚胎移植后30～35 d B 超检查见妊娠囊和原始心管搏动诊断为临床妊娠，持续妊娠至8 周及以上视为持续妊娠。

1.3 统计学方法应用Prism 8 进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用ANOVA 单因素方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验或Fisher 精确检验，检验水准α＝0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P＜1.5 ng/mL新鲜移植周期与P≥1.5 ng/mL全胚冷冻周期患者基本特征及胚胎质量比较由表1 可见，两组间患者临床基本特征相似。相对于P＜1.5 ng/mL 组（A 组），P≥1.5 ng/mL 组（B 组）平均Gn 用量及Gn 天数较多（P＜0.05），相应地，平均获卵数也较多（P＜0.05）。此外，卵裂率、D3优胚率和囊胚形成率差异无统计学意义，说明hCG日P 升高对胚胎质量无明显影响。

2.2 P＜1.5 ng/mL新鲜移植周期与P≥1.5 ng/mL全胚冷冻首次解冻周期临床结局比较P≥1.5 ng/mL全胚冷冻组（B 组）首次解冻共196 个周期，与P＜1.5 ng/mL 新鲜移植组（A 组）比较，临床妊娠率和持续妊娠率差异均无统计学意义。进一步按照移植胚胎发育时间比较，不论是卵裂胚移植还是囊胚移植，两组间临床妊娠率和持续妊娠率差异均无统计学意义。见表2。

2.3 全胚冷冻组按P高低组内比较促排卵、胚胎质量及妊娠结局由表3 可见，1.5 ≤P＜2.0 ng/mL组（B1 组），2.0 ≤P＜3.0 ng/mL 组（B2 组）和P≥3.0 ng/mL 组（B3 组）平均Gn 用量及Gn 时间差异有统计学意义（P＜0.05）。相对于B1 组，B2 组和B3组平均Gn 用量较多；相应地，B2 组和B3 组平均获卵数也较高（P＜0.05）。此外，三组间卵裂率、D3优胚率及囊胚形成率差异无统计学意义；临床妊娠率和持续妊娠率差异也无统计学意义。

表1 P＜1.5 ng/mL 新鲜移植周期（A 组）与P≥1.5 ng/mL全胚冷冻周期（B 组）患者基本特征及胚胎质量比较Tab.1 Comparison of patients′basic characteristics and embryo quality between fresh transfer cycles with progesterone＜1.5 ng/mL（Group A）and“freeze all”cycles with progesterone≥1.5 ng/mL（Group B） ±s

周期数女方年龄（岁）BMI（kg/m2）bFSH（IU/L）原发不孕比例（%）ICSI比例（%）平均Gn用量（IU）平均Gn时间（d）平均获卵数MII卵率（%）受精率/获卵数（%）多精受精率/获卵数（%）卵裂率（%）D3优胚率（%）囊胚形成率（%）优质囊胚率（%）A组897 29.87±3.96 23.46±3.64 8.78±3.53 47.05（422/897）18.84（169/897）1 835.79±656.17 8.55±1.89 11.36±4.92 83.96（8 544/10 188）72.06（7 341/10 188）4.53（462/10 188）98.23（7 211/7 341）52.28（3 770/7 211）55.15（2 441/4 426）34.33（838/2 441）B组199 29.49±4.23 23.63±4.04 8.54±3.46 44.72（89/199）22.11（44/199）1 952.00±708.98 9.15±1.98 14.41±7.06 80.54（2 289/2 842）68.44（1 945/2 842）4.82（137/2842）98.36（1 917/1 949）54.77（1 050/1 917）54.45（734/1 348）34.06（250/734）P值0.234 6 0.559 8 0.384 1 0.55 0.29 0.026 2＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.52 0.70 0.17 0.65 0.89

表2 P＜1.5 ng/mL 新鲜移植周期（A 组）与P≥1.5 ng/mL全胚冷冻组（B 组）首次解冻临床结局比较Tab.2 Comparison of clinical outcomes between fresh transfer cycles with progesterone＜1.5 ng/mL（Group A）and the first FET cycles after“freeze all”cycles with progesterone≥1.5 ng/mL（Group B）

表3 全胚冷冻组按P 高低组内比较促排卵、胚胎质量及妊娠结局Tab.3 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes among the cycles with“freeze all”strategy according to progesterone level ±s

注：与B1 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B2 组比较，△△P＜0.01

周期数平均P 值（ng/mL）平均年龄（岁）平均Gn 用量（IU）平均Gn 时间（d）平均获卵数MII 卵率（%）受精率/获卵数（%）卵裂率（%）D3 优胚率（%）囊胚形成率（%）优质囊胚率（%）移植周期数临床妊娠率（%）卵裂胚种植率（%）囊胚种植率（%）持续妊娠率（%）B1 组（1.5 ≤P＜2.0 ng/mL）37 1.82±0.13 30.11±4.68 1 740.95±566.59 8.21±1.39 10.95±5.60 81.23（329/405）67.90（275/405）97.45（268/275）57.84（155/268）56.00（98/175）30.61（30/98）34 50（17/34）30.43（7/23）52.17（12/23）44.12（15/34）B2 组（2.0 ≤P＜3.0 ng/mL）128 2.36±0.25 29.02±3.94 1 964.24±760.89 9.30±2.07**14.99±6.89**80.98（1 554/1 919）69.36（1 331/1 919）98.42（1 310/1 331）55.04（721/1 310）54.11（507/937）33.14（168/507）128 59.38（76/128）41.03（32/78）55.00（55/100）50.78（65/128）B3 组（P≥3.0 ng/mL）34 5.38±5.12 30.59±4.61 2 189.71±550.11**9.74±1.80**15.24±7.68**△△78.38（406/518）66.22（343/518）98.83（339/343）51.33（174/339）54.66（129/236）40.31（52/129）34 47.06（16/34）14.81（5/27）52.17（12/23）38.24（13/34）P 值＜0.001 0.098 3 0.026 9 0.002＜0.001 0.24 0.37 0.39 0.26 0.90 0.23 0.34 0.07 0.95 0.39

2.4 1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 患者行新鲜周期移植和全胚冷冻后首次解冻周期移植促排卵、胚胎质量及妊娠结局比较不论是平均Gn 用量和获卵数，还是胚胎质量和妊娠结局，两组间差异均无统计学意义。见表4。

表4 hCG日1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 患者行新鲜周期移植（C 组）和解冻周期移植（B1 组）促排卵、胚胎质量及妊娠结局比较Tab.4 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes of the cycles with progesterone level varying from 1.5 to 2 ng/mL between fresh transfer（Group C）and the first FET after“freeze all”strategy（Group B1） ±s

周期数平均年龄（岁）平均P 值（ng/mL）平均Gn 用量（IU）平均Gn 时间（d）平均获卵数MII 卵率（%）受精率/获卵数（%）移植周期数临床妊娠率（%）卵裂胚种植率（%）囊胚种植率（%）持续妊娠率（%）C 组63 29.24±3.94 1.77±0.15 1 847.61±690.59 8.85±1.86 12.43±5.28 81.86（641/783）70.24（550/783）63 53.97（34/63）41.84（41/98）46.67（7/15）46.03（29/63）B1 组37 30.11±4.68 1.82±0.13 1 740.95±566.59 8.21±1.39 10.95±5.60 81.23（329/405）67.90（275/405）34 50（17/34）30.43（7/23）52.17（12/23）44.12（15/34）P 值0.322 8 0.094 5 0.428 6 0.072 6 0.188 8 0.79 0.41 0.83 0.35＞0.99＞0.99

3 讨论

3.1 hCG日血清P 升高对体外受精妊娠结局的影响及机制众多研究和Meta分析结果提示，hCG日P 升高对IVF 新鲜周期临床结局有不利影响［3，10］，高于一定的临界值，建议全胚冷冻行解冻周期移植。本研究结果也表明，全胚冷冻后行解冻周期移植并不降低妊娠率，是一种可供选择的移植策略。IVF 周期中hCG日P 升高引起的子宫内膜变化，主要表现为：（1）子宫内膜组织学进展超过3 d；（2）胚胎种植相关蛋白如血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）异常表达；（3）与自然杀伤细胞（NK）活性相关的基因表达异常；（4）表观遗传图谱的差异［11］。因此，hCG日P 升高，可导致胚胎与子宫内膜发育不同步，降低临床妊娠率。但也有部分研究表明，对于高反应患者，P 升高与妊娠结局没有相关性［1］；或是P 升高的临界值与患者卵巢反应性有关，与低反应和正常反应患者相比，高反应患者P 升高对临床妊娠不利影响的临界值也较高。例如，大样本回顾性研究发现低反应、正常反应和高反应患者hCG日P 升高对妊娠不利影响的临界值分别为1.5、1.75 和2.25 ng/mL［10］。本研究结果也提示，当hCG日P 水平介于1.5～2.0 ng/mL 时，新鲜周期移植和解冻周期移植临床妊娠结局无明显差异，这可能与本研究对象排除低反应患者有关。此外，也有研究［12-13］认为hCG日P水平升高除了与促性腺激素总剂量、hCG日当天的E2 水平以及募集的卵泡数有关之外，可能还与促排卵方案类型、给予促性腺激素类型有关。因此，在目前的临床实践中，很难将单一P 水平作为IVF 周期临床妊娠的预测因子［14］。

3.2 hCG日血清P 升高对胚胎质量的影响尽管大部分研究证实hCG日P 升高对子宫内膜容受性有不利影响，而关于P 升高是否影响胚胎质量，目前还没有统一观点，有研究［6］认为hCG日P 升高可降低卵母细胞和胚胎质量，降低优质胚胎率，可利用胚胎率和累积活产率［15］；或是降低可利用胚胎率，但对全胚冷冻后续累积活产率无明显影响［16］。本研究结果提示hCG日P 升高并不影响胚胎质量，此结果与某些研究相似［17-18］。

3.3 hCG日血清P 升高与促排卵的关系本研究结果还提示，hCG日P 升高与给予的促性腺激素的总量和获卵数有关，高反应患者卵巢对促排卵刺激更易于在hCG日出现高孕酮。关于刺激周期中卵泡晚期P 升高的确切机制并不是很清楚。近年来研究表明，为获得多个卵泡的生长，相对高剂量外源性FSH 的给予，可导致hCG日P 的升高；hCG日P 水平与获卵数呈正相关，P 的升高可能是多个卵泡发育至成熟卵泡前激素分泌累积造成的［19-21］。最近一项体外试验研究表明，FSH 可刺激体外培养卵巢颗粒细胞中3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）的表达并增加其酶促活性，从而将孕烯醇酮转化为孕酮，促进颗粒细胞中P 的合成和输出，而无需黄素化［22］。因此，在IVF 刺激周期中，如果较高水平的FSH 持续刺激卵巢，类固醇前体的生成量可能超过卵巢有效将其转化为雌激素路径的能力，有可能导致孕激素在卵泡膜细胞中转化为雄激素延迟，从而导致孕激素累积和渗漏到体循环中，导致血清中P 水平升高。

本研究为回顾性分析，部分组样本量较少，存在一定的局限性。将来可扩大样本量，根据患者卵巢反应性，进行前瞻性随机对照研究，进一步评估hCG日血清孕酮升高对妊娠结局的影响。

综上所述，hCG日P 升高与促性腺激素总量和获卵数有关，对胚胎质量无明显影响，全胚冷冻后解冻周期移植不降低临床妊娠率。hCG日P 在1.5～2.0 ng/mL 时，新鲜周期移植和解冻周期移植妊娠结局相似，因此，对是否全胚冷冻需进行个体化处理，以便患者在IVF 助孕中有更多获益。