广西人群ULK1基因多态性与抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的相关性

饶金兰 朱艳 何佩耕 黎伟 黄莉 薛超

1广西医科大学第二临床医学院（南宁530021）；2广西医科大学第二附属医院肾内科（南宁530007）

抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，ANCA）相关性血管炎（ANCAassociated vasculitis，AAV）是一种严重的自身免疫性疾病，可引起全身系统性小血管炎症，常累及肾脏、肺脏和皮肤，甚至可威胁生命。目前，尽管AAV 的确切发病机制及病因未完全明确，但家族性病例报道及全基因组关联研究均提示，AAV 具有遗传倾向［1-2］。

自噬是维持细胞稳态和存活的关键，近年来，越来越多的证据提示，AAV 患者与自噬障碍密切相关。TANG 等［3］研究显示，自噬相关信号参与ANCA 新亚型抗溶酶体膜蛋白-2（LAMP-2）抗体诱导中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成和释放机制，并且NETs 的形成可被自噬抑制剂显著抑制。SHA 等［4］报道，经ANCA 阳性IgG 处理的中性粒细胞可诱导出更高的自噬水平，自噬诱导物可促进ANCA诱导的NETs的释放，反之则抑制NETs 的释放。ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可与Atg13、Atg101 和黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）共同组成自噬起始复合物。ULK1 复合物连接上游能量感应激酶与下游自噬核心机制的中心节点，介导自噬体的形成和成熟过程，启动了自噬的发生［5］。ULK1 作为该复合物最核心的组成部分，在激活自噬过程中起着关键性的作用。同时，ULK1 也被视为一个抑制自噬途径的有效靶点［6］。近年来，ULK1 基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）被证实与克罗恩病、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病及结核杆菌感染等感染性疾病的易感性存在关联［7-9］。由此可推测ULK1基因多态性与AAV 的易感性存在一定联系。然而，目前国内外尚未见相关研究，因此，本研究采用多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结合高通量测序法对ULK1 基因的rs9652059、rs7953348、rs7488085 三个位点进行基因分型，从而分析ULK1基因的单核苷酸多态性与广西人群AAV 的易感性之间的联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究所纳入的研究对象病例组为2005年1月至2019年1月在广西医科大学第一、二附属医院确诊为AAV 的门诊及住院的患者，共177 例，其中男68 例，女109 例。平均年龄为（53.85±15.04）岁。其诊断标准均严格参照2012年Chapel-Hill 国际血管炎命名会议标准［10］，同时排除继发性血管炎，如继发感染、药物、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。对照组为210例，其中男90例，女120 例，平均年龄为（51.31±12.78）岁。AAV 组与对照组的年龄及性别差异均没有无统计学意义（P＞0.05），具备可比性。所有研究对象及其直系三代亲属均为广西人群，且均签署书面知情同意书。本研究经广西医科大学第二附属医院医学伦理委员会审查后获批（2018 第KY-0100 号）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料的收集收集患者确诊时的临床资料及肾脏病理结果。临床资料包括患者的籍贯、性别、年龄、血压及起病时的发热、皮疹、关节痛、肌肉痛、咳嗽等临床症状；以及实验室检查资料如中性粒细胞、红细胞、血红蛋白、C 反应蛋白、血清尿素氮、肌酐、尿酸、白蛋白等。

1.2.2 外周血基因组DNA提取和保存用EDTA 抗凝采血管采集所有研究对象的外周静脉血各2 mL，并用由天根生化科技（北京）有限公司提供DNA提取试剂盒提取DNA，所有操作均严格按照说明书进行。将吸光度（A）值（A260/280 nm）在1.5～2.0，浓度＞50 ng/μL 的DNA 样品，置于-20 ℃冰箱保存用于后续实验。

1.2.3 SNP位点选取从1 000 genome（http：//grch37.ensembl.org/）下载ULK1 基因的位点信息，随后通过Haploview 4.2 软件进行SNP 的筛选，选择标准如下：（1）最小等位基因频率（MAF）≥0.05；（2）Hangy-Weinberg 平衡（HWE）检测P＞0.05。同时结合美国国家生物信息中心（NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）查询到SNP 的位置、MAF 等相关信息及既往研究中ULK1基因多态性位点与免疫性、炎症性疾病相关的位点中选取3个SNP位点［8，11］。

1.2.4 SNP 位点基因分型本研究采用多重PCR结合高通量测序技术（上海生工生物工程有限公司）进行SNP 位点基因型检测。引物序列如表1所示。

1.3 统计学方法采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。近似正态分布的计量资料的统计描述用均数±标准差表示，偏态分布的计量资料用中位数和四分位数间距；计数资料以计数或百分比表示。基因型及等位基因频率分布通过卡方检验或Fisher′s 确切概率法。临床特征中近似正态分布的计量资料的对比通过独立样本t检验或方差分析，偏态资料、等级资料则进行秩和检验。采用SNPStats 软件计算OR值与95%CI来评估5 种遗传模型下基因型与疾病风险的关系［12］。通过SHEsis软件分析Hangy-Weinberg 平衡、SNP 位点间连锁不平衡（LD）的分布规律及单体型频率。以P＜0.05（双侧）为差异有统计学意义。

表1 ULK1 基因SNP 位点rs9652059、rs7953348、rs7488085 的引物序列Tab.1 Primer sequences of SNPs rs9652059，rs7953348 and rs7488085 in ULK1

2 结果

2.1 等位基因频率、基因型分布及HWE 分析在本研究中387 个样本均基因分型成功（100%）。如表2所示，AAV 组与对照组均符合HWE 平衡，提示研究对象具有人群代表性。rs9652059 中的等位基因C 和rs7953348 中的等位基因T 与AAV 风险增加相关（P=0.028，OR=1.412，95%CI：1.038～1.919）。rs7488085 的等位基因频率在AAV 组和对照组中差异无统计学意义。而3 个SNP 位点的基因型在两组间的分布均无差异。

表2 ULK1 基因的SNP 位点在AAV 组及对照组中等位基因及基因型分布Tab.2 Distribution of allele and genotype of SNP in ULK1 gene in the AAV group and the control group 例（%）

2.2 遗传模型及临床资料分析如表3所示，在显性模型和对数加性模型中，ULK1 的rs9652059 和rs7953348 位点的基因型分布在AAV 组和对照组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。在经过年龄和性别调整之后，在显性模型中，AAV 组rs9652059位点中携带TC+CC 基因型者增加了AAV 患病风险（OR=1.66，95%CI：1.07～2.56，P=0.022）。rs7953348亦有相同结果。rs7488085 位点的基因型分布在5种遗传模型中均与AAV 的发病不相关，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 显性模型及隐形模型的临床资料分析隐性模型中TT+TC（rs9652059）、CC+CT（rs7953348）具有相对更高的中性粒细胞、红细胞计数、血红蛋白含量及C 反应蛋白水平（P=0.031、0.004、0.007、0.008），血尿素氮、肌酐、尿酸、白蛋白、血沉在两组间的分布差异均无统计学意义。而在显性模型中，临床资料在这两个位点的基因型分布的差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。

2.4 连锁不平衡及单体型分析将上述三个位点的基因型分布导入SHEsis在线软件中分析，结果显示，ULK1 基因的rs9652059-rs7953348 为完全连锁不平衡。但rs9652059-rs7488085、rs7953348-rs7488085间不存在连锁不平衡。三位点间所构建的单体型中最常见的为TCT、CTT。以TCT 为参照，单体型CTT增加了AAV的发病风险（OR=1.42，95%CI：1.02～1.98，P=0.039）。见表5。

3 讨论

AAV 是一种快速进展的严重的自身免疫性疾病。尽管近年来随着免疫抑制剂等治疗的发展，AAV 的五年生存率已显著提高，但相较年龄、性别匹配的普通人，AAV 患者病死率仍高达2.6 倍［13］，同时激素及免疫抑制剂的毒副作用，如心血管疾病、感染、血栓等严重威胁AAV 患者的生命健康及极大降低生存质量。

本研究发现rs9652059等位基因C和rs7953348等位基因T 为AAV 的风险等位基因。在经过年龄和性别调整之后，携带TC+CC（rs9652059）和CT+TT（rs7953348）者显著增加发病风险。然而，ULK1基因突变如何影响AAV 发病目前尚不清楚。近来多项研究揭示了，ANCA过度激活中性粒细胞引起大量的NETs 形成、释放及无序降解在AAV 的发

病机制中发挥着重要的作用［14-15］。自噬参与调节中性粒细胞脱颗粒及NETs 的形成和释放［16］，这在AAV 中ANCA 刺激中性粒细胞诱导的NETs 形成中也得到了证实［3-4］。ULK1 复合物是启动自噬过程的关键节点，可通过磷酸化beclin-1 等下游底物，募集其他自噬相关蛋白至吞噬体，促进自噬体的形成，从而启动自噬［17］。基于此，我们推测ULK1 rs9652059 等位基因C 和rs7953348 等位基因T 可通过导致自噬功能的紊乱引起NETs 的释放与降解失调，从而与AAV 存在密切联系。

表3 在不同遗传模型下ULK1 的SNP 位点与发病风险的相关性分析（经调整性别、年龄后）Tab.3 Genotypic model analysis of the relationship between SNPs rs9652059，rs7953348 and rs7488085 in ULK1 and the risk of AAV（after adjustment for gender and age）

表4 ULK1rs9652059 和rs7953348 在显性模型与隐性模型中的临床资料分析Tab.4 Analysis of SNPs rs9652059 and rs7953348 in ULK1 with clinical data M（P25，P75）

表5 SNP 位点构建的单体型与AAV 发病风险的关系（经调整性别、年龄后）Tab.5 Association analysis of haplotypes derived from SNPs in ULK1 and AAV risk（after adjustment for gender and age）

ULK1 是一种细胞质激酶，是酵母自噬相关蛋白Atg1 在哺乳动物的同源蛋白。ULK1 蛋白在大部分组织中广泛表达，其主要生物学功能是启动细胞自噬，还可参与调控肿瘤、神经退行性病变以及感染性疾病等疾病的发生发展［18］。CHEN 等［19］研究表明，ULK1 在胃癌组织及胃癌细胞中的过表达，靶向shRNA 敲低ULK1 可抑制胃癌细胞的存活和增殖。一项日本在帕金森病患者及老年对照组间的全转录组分析报道，在帕金森病患者的外周血单核细胞（PMBCs）中，ULK1 的蛋白表达水平与正常人相比显著升高［20］。ULK1缺陷型单核细胞内结核分枝杆菌复制增加，TNF分泌减少，自噬水平显著降低［9］。迄今为止，国内外尚未有关于ULK1基因多态性与AAV 易感性的相关研究，但其在其他疾病的研究正在被广泛开展。在加拿大的一项哮喘的家系研究［21］发现，ULK1 rs9652959 位点的等位基因C 被过度传递给哮喘后代（P=0.0126），其等位基因频率为0.85，提示等位基因C 在该项哮喘家系研究中为主要等位基因，控制哮喘性状在家系中传递。ZHANG 等［8］发现ULK1 rs9652059（C→T）的突变可以增加中国汉族人群强直性脊柱炎的易感性，以SNP rs9652059 为中心的单体型在病例组和对照组间的分布差异也有统计学意义。这与本研究中rs9652959 位点的主要等位基因在AAV 组及对照组中均为T，而风险等位基因为C 相反。这提示了ULK1 介导的自噬途径参与不同疾病的发病时所产生的效应不同，还可能存在其他区别于自噬的生理病理作用。此外，ULK1 基因的SNP rs7953348 与应用铂类化疗治疗非小细胞肺癌患者的临床获益和总生存相关［22］。在新西兰人群中发现SNP rs7488085，而不是rs7953348 与克罗恩病相关［11］。然而，在SNP rs7488085 与韩国儿童早发性克罗恩病的相关性研究中也未见阳性结 果［23］。在本研究中，SNP rs7953348 与AAV 的易感性相关，而rs7488085 的等位基因及基因型分布在AAV 组与健康对照组间均无差异。ULK1基因的SNP rs9652059位点等位基因C和rs7953348等位基因T 可能引起ULK1 的结构差异，影响ULK1 的激酶活性，导致磷酸化ULK1 的难易程度产生差异，从而改变自噬的启动，影响AAV 的易感性及预后。

本研究结果显示，中性粒细胞、红细胞计数、血红蛋白含量及CRP 水平在基因型的分布中存在差异。AAV 患者在活动期常发生贫血，多为肾性贫血［24］。由于网状红细胞的成熟过程，其中可能涉及到ULK1 介导的线粒体自噬［25］，ULK1 的多态性也可能导致红细胞计数及血红蛋白含量下降，可能进一步加重贫血症状。非特异性炎症标志物CRP 在炎症的活动期升高，并在稳定期显著下降［26］。中性粒细胞在AAV 的发病中为中心环节，因此中性粒细胞计数等相关指标也可能因中性粒细胞的过度激活而产生变化。研究［27］表明，在儿童PR-3 ANCA 相关性血管炎中，中性粒细胞计数与疾病活动性密切相关。有趣的是，在本研究中，临床资料的差异性分布是在隐性模型中观察到，而不是与AAV 易感性相关的显性模型。笔者认为，风险等位基因T（rs9652059）/C（rs7953348）与AAV 易感性之间可能存在更密切的相关性，而保护性等位基因C（rs9652059）/T（rs7953348）在发病后诱导一系列应激反应来对抗疾病的发展。本研究仍存在一定的局限性，样本量相对较小且未进行ULK1 及其相关自噬蛋白的功能性研究。接下来应该扩大样本量，并进行ULK1 与AAV 发病的生物机制研究，为阐明AAV的分子遗传学机制和ULK1 基因分子靶向治疗提供依据。

综上，ULK1 基因rs9652059、rs7953348 位点的多态性可能与广西人群AAV 的易感性相关，且与中性粒细胞、红细胞计数、血红蛋白含量及CRP 水平相关，ULK1 所介导的自噬可能参与广西人群AAV 的发病。