β咔啉类生物碱通过FAK/PI3K/AKT/mTOR通路对人胃癌SGC-7901荷瘤小鼠的影响

樊玉祥， 曾凡业， 张洪亮

(新疆医科大学第四附属医院肿瘤二科， 新疆 乌鲁木齐 830000)

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，也是我国第二高发肿瘤，中国胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183个国家中位于发病率第5位、死亡率第6位，并且胃癌死亡率将持续上升[1]。传统胃癌治疗手段包括手术、化疗和放疗，而放、化疗过程中会出现不同程度的毒副作用。因此，寻找低毒高效的抗肿瘤药物是目前热点的研究方向。β咔啉类生物碱对人胃癌细胞SGC-7901有诱导凋亡的作用，部分体内实验表明β咔啉类生物碱可使人胃癌细胞SGC-7901荷瘤小鼠肿瘤组织瘤重减轻[2,3]，但其机制尚不明确。为了验证从骆驼蓬提取的β咔啉类生物碱对胃癌的治疗作用，采取SGC-7901胃癌细胞建立皮下移植瘤小鼠模型，研究β咔啉类生物碱对荷瘤小鼠的抑瘤作用，并从分子生物学角度探索β咔啉类生物碱抗胃癌的作用机制，为临床进一步运用β咔啉类生物碱治疗胃癌提供研究方向。

1 资料与方法

1.1一般资料:昆明小鼠50只，SPF级饲养，雌雄对半，体重18.0±3.1g，购自新疆医科大学动物实验中心，动物许可证号SCXK(新)2016-0003。SGC-7901细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司；β咔啉类生物碱由北京中医药大学刘永刚教授鉴定；人胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；氟尿嘧啶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；RPMI 1640细胞培养液及胎牛血清购自Hyclone公司；苏木精-伊红染色液购自山东鲁抗医药股份有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；BCA定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT、mTOR抗体购买自Cell Signaling公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养:按常规肿瘤细胞培养方法按时还液、传代。将处于对数生长期的SGC-7901细胞调整至备用状态。

1.2.2动物模型制备:荷瘤小鼠在SPF环境饲养一周。按数字表法随机分为5组，空白对照组，阳性药物组(氟尿嘧啶组)，β-咔啉类生物碱低、中、高剂量组，每组10只。各组腹腔注射环磷酰胺，连续7d，然后取对数生长期的细胞使用RPMI 1640细胞培养液调整至细胞密度为1×107/mL，将0.2mL细胞混悬液接种于小鼠背部。阳性药物组腹腔注射氟尿嘧啶267mg/kg，连续2d，空白对照组腹腔注射生理盐水1mL，连续14d。β-咔啉类生物碱低、中、高剂量组分别使用2.5mg、5mg、7.5mg/kg口服给药，连续14d。接种10d后，使用超声探查接种处，皮下有不均匀回声考虑接种成功。给药过程中对小鼠称重，并观察精神状态、活动、饮食等一般情况。第21天处死所有小鼠，并按要求留取标本。

1.2.3肿瘤质量的测定及抑瘤率计算:实验第21天使用颈椎脱臼法处死所有小鼠。剥离瘤体，使用电子天平称取瘤组织重量。使用以下公式计算抑瘤率：抑瘤率=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量

1.2.4HE染色观察瘤体组织:将标本用10%多聚甲醛固定包埋脱水处理，做成石蜡切片。依次加入不同浓度二甲苯、乙醇中处理，先使用苏木素处理，再使用伊红处理，其后使用无水乙醇、二甲苯中处理，最后使用树脂封片，上镜观察。

1.2.5TUNEL检测细胞凋亡:将标本使用10%多聚甲醛固定包埋脱水处理，切成5mm切片。加0.01M TBS 1∶200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化，使用TdT和DIG-d-UTP后使用TBS洗片，加封闭液，用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体，稀释SABC后使用DAB显色，其后使用苏木素轻度复染后封片。上镜观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。

1.2.6免疫组化染色技术检测瘤体组织BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的表达:将标本使用10%多聚甲醛固定包埋脱水处理，处理成5mm切片。使用相应抗体孵育并洗涤、DAB显色后上镜观察。每个切片随机选取10个视野，细胞浆显示棕黄色的细胞为阳性细胞。

1.2.7RT-PCR检测肿瘤组织中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的mRNA的表达:收集经β-咔啉类生物碱处理24h的SGC-7901肿瘤瘤体组织，按RT-PCR试剂盒要求进行逆转录，合成cDNA，然后再进行扩增。BCL-2的扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；Bax的扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；FAK的扩增条件：95℃预变性2min，94℃变性40s，46℃退火40s，72℃延伸1min，28个循环；PI3K的扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸40s，30个循环；AKT的扩增条件：95℃预变性3min，94℃变性40s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；mTOR的扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，46℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；β-actin的扩增：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。PCR扩增产物4μL于质量浓度为1.5%的琼脂凝胶进行电泳，用凝胶成像系统进行分析，以β-actin为内参基因，使用2-△△CT法计算基因表达的相对变化值，实验中所用引物序列，见表1。

表1 检测引物序列

1.2.8Western blot技术检测肿瘤组织中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR蛋白的表达:β咔啉类生物碱处理24h的SGC-7901肿瘤组织，经液氮研磨之后，收集上清液后测定蛋白含量，电泳，转膜，分别加入BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR一抗(BCL-2、Bax为1：600，FAK为1：400，PI3K、AKT、mTOR为1：800)，室温孵育，二抗孵育，封闭，TBST反复漂洗，显色后用ChemiScope mini化学发光仪检测并拍照用，β-actin为内参蛋白，进行相对定量表达检测。

2 结 果

2.1小鼠一般情况:本实验成功复制免疫缺陷动物模型。除β咔啉类生物碱高剂量组有一只死亡外，其余组均无死亡。各组实验动物在实验过程中无明显拒食、腹泻等现象。

表2 各组瘤体重量与成瘤率的比较

2.2瘤重及抑瘤率:β咔啉类生物碱高剂量组的瘤重明显低于空白对照组(t=4.539，P=0.000)，高剂量组的瘤重明显低于低剂量组(t=2.163，P=0.025)，高剂量组与中剂量组的瘤重无显著差异(t=0.356，P=0.756)；高剂量组与阳性对照组的瘤重也无显著差异(t=0.418，P=0.613)；β咔啉类生物碱中剂量组的瘤重明显低于空白对照组(t=3.398，P=0.003)，中剂量组的瘤重又显著低于低剂量组(t=2.057，P=0.037)；β咔啉类生物碱低剂量组与空白对照组的瘤重无显著差异(t=0.243，P=0.836)；阳性对照组的瘤重明显低于空白对照组(t=4.472，P=0.002)，阳性对照组的瘤重明显低于低剂量组(t=2.163，P=0.021)；以上结果说明与空白对照组相比，β咔啉类生物碱中剂量组、高剂量组和阳性对照组的瘤重均减小(P<0.05)，差异具有统计学意义，见表2。

2.3β咔啉类生物碱对胃癌组织病理变化的影响：空白对照组瘤细胞体积大小不一，密度大、深染，异型性明显，浸润性生长，周边部瘤细胞生长活跃；阳性对照组瘤细胞弥漫排列，异型性明显，淋巴细胞浸润较明显，部分瘤细胞退变、坏死，染色较深；低剂量组瘤细胞排列整齐，仅有少量的癌细胞坏死，染色较浅；中剂量组瘤细胞排列呈巢团状，淋巴细胞浸润较轻，瘤细胞部分异型性明显，部分坏死；高剂量组瘤细胞排列呈巢团状，淋巴细胞聚集浸润，瘤细胞异型性明显，大量退变、坏死。这些结果表明β咔啉类生物碱具有很强的抑瘤作用，见图1。

图1 β咔啉类生物碱对胃癌组织病理学变化的影响

2.4β咔啉类生物碱对胃癌细胞凋亡的影响:棕黄色为凋亡细胞，蓝色为阴性细胞。从图中可以看出，空白对照组肿瘤细胞凋亡最少；阳性组和低剂量组有部分凋亡细胞；中剂量和高剂量处理后，肿瘤凋亡细胞的数量明显增多，凋亡细胞数量高于空白对照组和阳性组。结果表明β咔啉类生物碱中剂量和高剂量可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抑瘤作用，见图2。

图2 β咔啉类生物碱对胃癌细胞凋亡的影响

2.5β咔啉类生物碱对凋亡相关蛋白表达的影响:阳性细胞为棕色颗粒。与空白组相比，β咔啉类生物碱低剂量组中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR无显著差异；与空白组相比，阳性组、中剂量组和高剂量组的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表达显著下降，Bax蛋白显著上升，阳性细胞明显增多；与低剂量组相比，阳性对照组、中剂量组和高剂量的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表达进一步下降，Bax蛋白进一步上升，见图3。

图3 β咔啉类生物碱对凋亡相关蛋白表达的影响

2.6Western blot分析:如表3和图4所示，与空白对照组相比，β咔啉类生物碱低剂量组中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR表达水平无显著差异；与空白对照组相比，阳性组、中剂量组和高剂量组中Bax蛋白表达显著提高，差异具有统计学意义(t=14.219、12.579、15.173，均P<0.01)，BCL-2(t=10.613、9.345、11.527)、FAK(t=11.287、10.982、13.664)、PI3K(t=18.241、16.793、19.217)、AKT(t=13.358、10.284、13.962)及mTOR(t=8.218、6.612、9.054)蛋白表达显著下降(均P<0.01)；与低剂量组相比，阳性组、中剂量组和高剂量组的Bax蛋白表达进一步上升(t=4.213、3.216、2.614，均P<0.05)，BCL-2(t=5.129、3.256、4.218)、FAK(t=3.276、4.123、5.016)、PI3K(t=3.205、6.651、3.254)、AKT(t=4.164、3.217、5.027)及mTOR(t=4.327、3.275、4.761)蛋白表达进一步下降(均P<0.05)。这些结果都与免疫组化分析结果一致，见表3、图4。

图4 β咔啉类生物碱对胃瘤组织中相关蛋白表达的影响

表3 β咔啉类生物碱对胃瘤组织中相关蛋白表达的影响

2.7β咔啉类生物碱对肿瘤组织相关基因表达的影响:与空白组相比，β咔啉类生物碱低剂量组中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的的mRNA表达水平无显著差异；与空白对照组相比，阳性组、中剂量组和高剂量组中Bax蛋白的mRNA表达显著上升(t=15.163、13.218、17.895，均P<0.01)，BCL-2(t=20.916、11.785、22.164)、FAK(12.183、10.126、15.871)PI3K(t=16.927、13.252、14.913)、AKT(t=12.123、10.942、14.428)、及mTOR(t=16.927、13.252、14.913)蛋白的mRNA表达显著下降(均P<0.01)，差异均具有统计学意义；与低剂量组相比，阳性组、中剂量组和高剂量组的Bax蛋白的mRNA表达进一步升高(t=3.125、3.421、4.013，均P<0.05)，BCL-2(t=6.342、5.345、4.165)、FAK(t=4.328、5.329、6.021)、PI3K(t=4.327、5.321、3.828)、AKT(t=4.326、6.327、3.421)及mTOR(t=4.327、5.424、5.189)蛋白的mRNA表达进一步降低(均P<0.05)，差异均具有统计学意义。该趋势与上述蛋白结果一致，见表4。

表4 β咔啉类生物碱对胃瘤组织中相关基因表达的影响

3 讨 论

骆驼蓬喜生于路旁、平原、戈壁等干旱处，具有助阳化气、祛湿散寒之功效。研究结果表明，其有效成分去氢骆驼蓬碱对肿瘤细胞有明显抑制作用[4]。通过前期的细胞实验得知，β咔啉类生物碱有一定抗肿瘤作用，主要表现在诱导凋亡、影响细胞增殖等方面[5]。而肿瘤的发生发展与“血管再生理论”密切相关[6]。β咔啉类生物碱对血管再生相关FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路有何影响报道较少。本研究从细胞、动物实验层面，运用分子生物学手段，研究β咔啉类生物碱对FAK/PI3K/AKT/mTOM通路的影响，阐明β咔啉类生物碱抗胃癌的作用机制。

本研究发现经β咔啉类生物碱中剂量和高剂量治疗后，小鼠瘤体重量显著降低，提示β咔啉类生物碱可以通过抑制瘤体的生长，从而发挥抗胃癌作用，其效果明显优于β咔啉类生物碱低剂量组。HE和TUNEL染色是评价胃癌病变组织和凋亡的重要指标，结果表明，β咔啉类生物碱中剂量组和高剂量组能破坏胃癌细胞组织，诱导胃癌细胞的凋亡，其效果随着β咔啉类生物碱剂量的增大而增强，进一步说明β咔啉类生物碱抗胃癌机制可能与破坏胃癌细胞组织，诱导胃癌细胞的凋亡有关。

细胞凋亡在肿瘤发生、转移及粘附过程中发挥着重要的作用。其中促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2，是凋亡的关键调节因子，在肿瘤细胞中，Bcl-2过表达与Bax形成异二聚体，发挥抑制凋亡作用。本研究中采用免疫组化、Western blot和RT-PCR研究结果表明，β咔啉类生物碱中剂量和高剂量组干预后瘤体内中Bax蛋白有较高的表达，而Bcl-2表达显著降低，效果优于β咔啉类生物碱低剂量组。结果表明，β咔啉类生物碱通过调节Bcl-2和Bax的表达，促进Bax蛋白形成同源二聚体，从而诱导胃癌细胞发生凋亡。这可能是β咔啉类生物碱抗胃癌的作用机制之一。

粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一种细胞质酪氨酸激酶，高水平的FAK诱导肿瘤细胞转移，并且与胃癌的不良反应相关[7]。研究结果表明，FAK的高表达可以抑制胃癌细胞的粘附和迁移能力。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( phosphoinositide 3 kinase / protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路主要参与调节肿瘤细胞的增殖和凋亡等细胞转导过程[8]。PI3K是一种磷脂酰肌醇蛋白激酶，与AKT蛋白的Ser308位点发生磷酸化，从而导致AKT蛋白的激活。活化后的AKT磷酸化激活下游蛋白mTOR[9]。mTOR主要参与调控肿瘤细胞周期、增殖和凋亡的过程，在肿瘤细胞生长和死亡之间发挥着重要的作用[10]。本研究结果表明，β咔啉类生物碱中剂量组和高剂量组处理后，肿瘤细胞内FAK和BCL-2蛋白表达显著地下降，而Bax蛋白表达升高，其效果优于β咔啉类生物碱低剂量组。表明FAK主要参与诱导细胞凋亡过程。同时PI3K和AKT作为FAK的下游蛋白，PI3K和AKT蛋白的表达也显著下降。结果表明，β咔啉类生物碱通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制胃癌细胞生长。

综上所述，β咔啉类生物碱能显著抑制移植瘤体生长，诱导胃癌细胞的凋亡，其作用机制可通过提高Bax蛋白表达，降低FAK、PI3K、AKT、mTOR、BCL-2、和Bax蛋白表达有关。此次实验与血管新生的相关MAPK/ERK通路及VEGF相关蛋白尚未研究，本课题组将在今后的实验中做进一步深入研究，探讨β咔啉类生物碱抗肿瘤血管再生的分子机制。