研究无创产前DNA诊断高龄孕妇异常核型的价值

马志慧

(河北省承德市中医院检验科， 河北 承德 067000)

高龄孕妇主要是指分娩年龄≥35岁的孕妇，近年来，由于我国二孩政策的全面开放，加之生育年龄的不断推迟，临床上高龄孕妇人数日益增多[1]。然而，由于高龄孕妇机体状态出现显著的改变，不但会增加妊娠并发症发生风险，同时亦会导致胎儿染色体非整倍体的发生几率增加，从而增加了新生儿先天性缺陷疾病的发生风险，不利于我国人口素质的提高[2]。因此，针对高龄孕妇，国内外的专家学者均建议实施产前诊断，以确定胎儿染色体异常情况，避免先天性缺陷儿的出生。羊膜腔穿刺羊水细胞染色体核型分析是全球范围内所公认的产前诊断有效手段之一，其在胎儿染色体异常检测方面具有一定的价值。但该检测方式属于有创新检查，可能引发早产、宫内感染以及流产的风险，存在一定的局限性，不利于临床推广普及。随着近年来分子生物学技术以及医学遗传学的逐渐发展，无创产前DNA检测(NIPT)技术开始被应用临床孕妇产前诊断中。迄今为止，国内关于高龄孕妇NIPT检测的相关研究并不多见。鉴于此，本文通过探究NIPT诊断高龄孕妇异常核型的价值并进行分析，旨在为NIPT用于高龄孕妇产前诊断中提供理论依据。现作以下报道。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取我院从2016年1月至2019年1月收治的自愿接受NIPT检测的高龄孕妇1467例作为研究对象。年龄35～47岁，平均年龄(39.74±2.33)岁。纳入标准：①年龄≥35岁；②均自愿接受NIPT检测；③均为单胎妊娠；④孕周在12～24周之内。已获得纳入对象及其家属同意，并得到医院伦理委员会批准。

1.2研究方法:①高龄孕妇外周血采集和处理：通过EDTA-K2管分别采集所有受试者的外周血5mL，于4℃条件下，以4000r/min作为离心条件，进行时长10min的离心处理。随后在同样的温度条件下，以12000r/min作为离心条件，进行时长10min的离心处理。获取血浆保存在-20℃冰箱中备用，实施后续大规模平行测序。②胎儿游离DNA采集：通过离心柱法提取孕妇外周血血浆游离DNA的提取，具体操作务必以试剂盒说明书进行，相关试剂盒购自华大生物科技有限公司。③文库的制备及DNA测序：具体方式为半导体测序法，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，相关检测试剂盒为胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒。严格遵循说明书操作完成孕妇外周血血浆游离DNA文库的构建。④测序结果分析：通过BGISEQ-100完成测序后，将测序数据与人参考基因组进行比对，统计21号、18号以及13号染色体的有效数据占总有效数据的比例。并对上述相关染色体的Z值进行计算。通过基于二元假设的Z-score值对某条染色体是否存在拷贝数目异常进行评价。评价标准：若Z值≥3，提示非整倍体高风险，反之，若Z值<3，提示非整倍体低风险。⑤核型分析：以羊水穿刺检测完成核型分析确诊，具体操作如下：于超声诊断的引导下，于妊娠18～24周进行羊膜腔穿刺术，采集羊水20mL。穿刺获得的标本行常规羊水细胞培养、制片以及G带显色。通过蔡司全自动染色体核型分析系统采集、保存染色体核型图。

1.3观察指标：分析24例行NIPT检测异常孕妇的结果，对比24例行NIPT检测结果异常和羊水核型验证结果，以及不同年龄高龄孕妇的异常核型检出率。

1.4统计学方法:以SPSS20.0软件实施数据的分析，计数数据通过n(%)表示，予以χ2检验。P<0.05即为差异显著。

2 结 果

2.124例行NIPT检测异常孕妇的结果分析：1467例高龄孕妇行NIPT检测异常人数24例，其中6例提示为21三体高风险，4例提示为18三体高风险，3例提示为13三体高风险，7例提示为性染色体异常，4例提示为其他染色体异常。24例孕妇均行羊水穿刺检测，确诊胎儿染色体异常疾病人数13例，包括21三体6例，18三体3例，13三体1例，性染色体异常2例，其他染色体异常1例。剩余11例羊水验证核型正常孕妇继续妊娠，见表1。

表1 24例NIPT检测异常孕妇的结果分析

表2 24例行NIPT检测结果异常和羊水核型验证结果对比

2.224例行NIPT检测结果异常和羊水核型验证结果对比:NIPT检测与羊水核型验证结果的符合率为54.17%，其中NIPT检测21三体、18三体、13三体、性染色体异常、其他染色体异常与羊水核型验证结果的符合率分别为100.00%、75.00%、33.33%、28.57%、25.00%，见表2。

2.3不同年龄高龄孕妇的异常核型检出率对比:年龄≥40岁高龄孕妇异常核型检出率为1.82%(9/494)，相较于年龄35～39岁高龄孕妇的0.41%(4/973)，明显更高(P<0.05)，见表3。

表3 不同年龄高龄孕妇的异常核型检出率对比

3 讨 论

我国属于出生缺陷儿高发国家之一，相关数据表明，我国出生缺陷儿的发生率约为5.6%，且每年增加的出生缺陷儿例数约为90万[3]。而染色体异常是引起出生缺陷的最主要因素之一，在新生儿中的发生率可达0.6%。其中21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的发生率在围生期常染色体非整体中占比约为95%[4,5]。因此，对孕妇实施染色体异常的筛查显得尤为重要，亦是产前诊断重要内容之一[6]。羊水穿刺检测是染色体异常检测的“金标准”，但作为有创检测手段之一，羊水穿刺检测可能对胎儿造成误伤，甚至引发流产以及宫内感染等，加上该技术检测所需时间较长，技术要求较高以及工作强度较大等缺陷，导致大部分的高龄孕妇存在不同程度的顾虑，继而拒绝接受该项检查，从而可能导致染色体异常胎儿的漏诊，最终导致出生缺陷儿的出生，增加了家庭及社会负担[7]。

本文结果发现，NIPT检测21三体、18三体、13三体、性染色体异常、其他染色体异常与羊水核型验证结果的符合率分别为100.00%、75.00%、33.33%、28.57%、25.00%。其中司艳梅等的研究报道表明[8]，NIPT检测21三体、18三体、13三体、性染色体异常、其他染色体异常与羊水核型验证结果的符合率分别为100.00%、75.00%、33.33%、37.50%、25.00%。两项该研究高度一致，这提示了NIPT检测应用于高龄孕妇中，对21三体、18三体的检测符合率较高，可能成为高龄孕妇产前染色体异常诊断的有效手段之一。其中NIPT主要是通过大规模平行测序技术深度测序母体外周血中的游离DNA，从而获取胎儿染色体的信息，并得出染色体数目异常风险程度[9]。然而，NIPT检测与羊水核型验证结果的符合率为54.17%，这提示了NIPT当前仅可作为产前染色体非整倍体评估的一种补充检测手段，尚且无法完全替代细胞遗传学诊断。分析原因，笔者认为NIPT所筛查的目标疾病相对较少，仅针对胎儿的21/18/13-三体综合征等非整倍体异常，尚且无法有效对胎儿染色体异位、微缺失等异常疾病进行诊断。与此同时，孕妇若近期接受过异体输血、细胞治疗以及移植手术等，亦或是孕周计算不准确，均可能导致游离胎儿DNA的含量相较检出量更低，进一步影响检测结果。此外，染色体三体型疾病中具有部分嵌合体，从而会导致NIPT检测的灵敏度以及特异度下降。另外，年龄≥40岁高龄孕妇异常核型检出率为1.82%，相较于年龄35～39岁高龄孕妇的0.41%明显更高(P<0.05)。这和既往研究高度一致[10]，说明了随着年龄的不断提高，高龄孕妇胎儿染色体异常疾病的发生风险随之增加。究其原因，笔者认为随着年龄的不断增长，孕妇的卵巢储备功能下降，卵泡刺激素水平随之升高，卵泡期缩短，从而使得监督卵泡发育机能可能异常，导致卵母细胞减数分裂过程中出现染色体的异常分离，进一步引起胎儿染色体异常的发生。

综上所述，NIPT检测可用于高龄孕妇产前诊断中，且对21三体、18三体的检测价值较高。然而，该检测技术尚且无法取代传统有创检测技术，仍需进一步研究。