HPLC测定金银花中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸的含量
2020-10-29龚菊梅胡晓妹何晓丽刘修树方丽波范高福范雪梅
龚菊梅，胡晓妹，何晓丽，刘修树， 方丽波，范高福，沈 慧，范雪梅
(1.合肥职业技术学院，安徽 合肥 230038; 2.福建省莆田市中医医院，福建 莆田 351100；3.清华大学 化学系，北京 100084)
本品为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.) 的干燥花蕾或带初开的花。研究表明，不同产地、不同品种金银花药材化学品质差异较大。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热[1]。功效方面具有抑菌[2]、抗病毒[3-4]、解热抗炎[5-6]、保肝、止血、抗氧化[7]、免疫调节[8]等作用。目前《中国药典》规定了金银花的质量测定的成分有绿原酸和木犀草苷。绿原酸作为金银花含量最丰富的咖啡酰基奎宁酸类成分，其含量常用来作为控制金银花的质量的标准[9-10]。
由于金银花是作为清开灵注射液的原料之一，在清开灵注射液中不含木犀草苷，因此，只考察了咖啡酰基奎宁酸类绿原酸、新绿原酸和异绿原酸含量。本实验采用一评多测法，以绿原酸为内标，建立新绿原酸和异绿原酸的校正因子，通过高效液相色谱法对9批金银花药材中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸含量测定方法进行研究，为金银花及其产品的质量控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 仪器 SHIMADZU LC-2010A型高效液相色谱仪(带有SPD-M10A型二极管阵列检测器，自动进样器)(日本岛津仪器公司)；Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XP250分析天平(梅特勒-托利多公司)；101-1AB型电热鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)。
1.1.2 试剂 乙腈、甲醇(DIKMA和FISHER公司，色谱纯);甲酸(北京第二化工厂，分析纯);超纯水(自制)；绿原酸(中国药品生物制品检定所 批号：120712，质量分数为99.3%);金银花药材(明兴药业有限公司提供，产自河南封丘)。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱选用Phenomenex Luna C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：A 0.1%甲酸-水，B 乙腈；梯度洗脱如下：0～3 min, 5%B; 3～13 min, 5%～15%B;13～15 min,15%B; 15～50 min，15%～30%B。流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：240 nm。
1.2.2 供试品溶液的制备 将金银花药材粉碎，取本品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15 mL的纯水，超声处理30 min，摇匀、滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜，即得。
1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品15.65 mg，置于25 mL容量瓶中，用纯化水定容，作为母液，将绿原酸对照品母液分别稀释2、4、5、10、20倍，过0.45 μm滤膜，即得。
1.2.4 线性关系的考察 精密量取“1.2.3”节下的对照品溶液，分别过0.45 μm微孔滤膜，进样20 μL，记录峰面积，以平均峰面积值(Y)对浓度(X)进行线性回归，得到绿原酸标准曲线。
1.2.5 系统适应性试验 取“线性关系考察”节下的对照品溶液，重复进样5次，记录峰面积和保留时间，计算RSD值。
1.2.6 精密度考察 取金银花药材，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，重复进样6次，每次进样20 μL，记录绿原酸、新绿原酸和异绿原酸峰的峰面积，计算相对标准偏差(Sr)值。
1.2.7 重复性考察 取金银花药材，精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备样品供试液6份，每份样品进样20 μL，记录绿原酸、新绿原酸和异绿原酸峰的峰面积，计算RSD值。
1.2.8 稳定性考察 取金银花药材，精密称定，按供试品溶液制备方法制备样品供试液，分别于0、2、4、8、24、48 h进样，记录绿原酸、新绿原酸和异绿原酸峰的峰面积，计算RSD值。
1.2.9 加样回收率 取金银花药材，精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备样品供试液6份，每份样品进样20 μL，记录绿原酸、新绿原酸和异绿原酸峰的峰面积，计算加样回收率。
1.2.10 含量测定 将9批金银花药材按照“1.2.2”项下制备成供试品溶液后，进样20 μL，得到峰面积，计算含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系的考察
绿原酸标准曲线图如图1所示。回归方程为y=67688483.018x-592968.725，r值为0.9993，绿原酸在0.013～0.526 mg/mL的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，测得异绿原酸和新绿原酸的相对校正因子分别为1.027和1.018。
图1 绿原酸的标准曲线
2.2 系统适应性试验
通过绿原酸对照品五次进样后纪律的保留时间和峰面积，计算得到的绿原酸保留时间和峰面积的RSD值为0.43%、1.47%，均符合要求，说明该方法下的仪器系统适应性良好。
2.3 精密度考察
通过精密度计算结果可知，绿原酸积分平均值为8 324 466、RSD为2.34%，新绿原酸峰面积积分平均值为3 307 110、RSD为4.08%，异绿原酸峰面积积分平均值为762 902、RSD为2.88%。结果显示，金银花药材中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸峰面积的RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。
2.4 重复性考察
通过重复性计算结果可知，绿原酸积分平均值为8 324 466、RSD为2.34%，新绿原酸峰面积积分平均值为3 307 110、RSD为4.08%，异绿原酸峰面积积分平均值为769 524、RSD为2.78%。结果显示，金银花药材中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸的RSD均小于5%，表明该测定方法的重复性较好。
2.5 稳定性考察
通过稳定性计算结果可知，绿原酸积分平均值为8 325 305、RSD为2.22%，新绿原酸峰面积积分平均值为3 367 522、RSD为3.72%，异绿原酸峰面积积分平均值为777 860、RSD为2.74%。结果显示，金银花中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸的RSD均小于5%，表明供试品溶液在48 h内稳定性较好。
2.6 加样回收率
加样回收率结果如表1所示，金银花药材中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸加样回收率分别为99.53%、99.73%、100.23%，RSD分别为4.27%、2.49%、1.58%，均小于5%，表明该测定方法的符合金银花定量分析要求。
表1 金银花药材中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸加样回收结果
2.7 含量测定
由表2和图2可知，9批次金银花药材含量变化较大，绿原酸含量测定范围为1.538%～2.147%。其RSD大于5%。其测定样品HPLC图谱详见图3。
表2 9批金银花药材含量测定结果
图2 9批金银花药材含量柱状图
1：绿原酸；2异绿原酸；3新绿原酸
3 结论与讨论
新绿原酸与异绿原酸为绿原酸的同分异构体，均为单咖啡酰基奎宁酸，差别仅在于咖啡酰基与奎宁酸连接位置不同，从紫外吸收光谱来看，在清开灵成品中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸的紫外吸收波长分别为232、242、235 nm。故本研究采用240 nm波长作为清开灵成品中三种成分的检测波长。
金银花作为清开灵注射液组方药材之一，其成分绿原酸、新绿原酸和异绿原酸含量的高低可作为表征清开灵质量好坏的标准之一。由含量测定结果来看，9批明兴药业提供的金银花中绿原酸、新绿原酸和异绿原酸的含量变化较大，RSD大于5%。说明不同批次的金银花对于清开灵的疗效有影响，因而需要更深层次探索研究，以确保清开灵注射液的质量。
