血管紧张素受体和脑啡肽酶双效抑制剂在急性心肌梗死早期的应用价值

刘东升 张侃迪 毕昌龙 张鹏 张田田 张俊峰

急性心肌梗死(AMI)患者如因为各种原因未能及时行再灌注治疗，则其受损心肌重构，患者最终可发展为缺血性心肌病、心力衰竭(心衰)[1-2]。

依照现行临床路径管理，AMI确诊后如无禁忌应及早常规使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)抑制剂，以遏制心肌纤维化，对抗心室重构，延缓心衰进程[3]。随着新型血管紧张素受体和脑啡肽酶双效抑制剂(ARNI)的出现，特别是基于PARADIGM-HF的试验结果，沙库巴曲缬沙坦钠片(诺欣妥，LCZ696)对抗心衰的作用受到广泛关注[4]。然而，AMI早期应用ARNI 是否优于目前常规应用的RAAS抑制剂，包括血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体抑制剂(ARB)尚无定论。本研究借助小鼠AMI模型，评估LCZ696在小鼠AMI早期应用的确切价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10～12周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心，饲养环境及动物护理严格按国家标准执行。

1.2 主要试剂

玉米油、LCZ696、缬沙坦购自大连美仑生物技术有限公司，Masson染色试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1.3 小鼠AMI模型的建立

乙醚棉球诱导小鼠麻醉后固定小鼠，脱毛膏脱去待手术区毛发，碘伏消毒，剪开颈部皮肤，暴露气管，气管插管后连接呼吸机。根据小鼠体质量调节潮气量(600～800 μL/30 g)，呼吸比设置为1︰1，频率为100～120次/min。给予异氟烷吸入麻醉，麻醉维持浓度为5%。剪开胸部皮肤和肌肉，横行打开胸腔，采用4-0手术缝合线悬吊肋骨，暴露小鼠心脏，采用7-0缝合线结扎小鼠心脏左前降支，确定冠状动脉血流阻断后，排除胸腔空气，采用4-0手术缝合线关胸，缝合胸部皮肤，去除气管插管，等待小鼠苏醒。

1.4 实验分组

AMI建模后第1天，采用心超检测小鼠心功能，将左室射血分数(LVEF)为25%～40%的小鼠纳入手术组，按LVEF数值大小排序后依次分至模型组、缬沙坦组和LCZ696组。对照组操作同上，只是不行左前降支结扎。

1.5 药物干预

予对照组和模型组玉米油灌胃，缬沙坦组将缬沙坦溶于玉米油后按9.1 mg·kg-1·d-1进行灌胃，LCZ696组将LCZ696溶于玉米油后按20 mg·kg-1·d-1灌胃。给药溶剂体积一致，固定给药时间，每日顿服。

1.6 超声检测

AMI后第1、7、14、28、42天在M模式下行小鼠超声检测。

1.7 Masson染色

速取小鼠心脏，生理盐水轻轻洗去残余血液，4%多聚甲醛固定，酒精脱水，透明化后石蜡包埋切片。按试剂盒说明书行Masson染色，显微镜下观察心肌细胞和间质纤维化情况，拍照并使用Image Pro Plus 6.0软件计算纤维化面积。

1.8 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 5 软件作图分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用未配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMI早期应用LCZ696，心功能改善优于单用缬沙坦

在小鼠AMI后第7、14、28、42天行LVEF检测。各手术组与对照组相比，所有检测时间节点LVEF差异均具有统计学意义(P均<0.05)。小鼠AMI后第7天，LCZ696组LVEF即明显高于模型组(P=0.043)，缬沙坦组LVEF虽然高于模型组，但差异不具有统计学意义(P=0.1103)。小鼠AMI后第14天，缬沙坦组LVEF开始明显高于模型组(P=0.0068)。随着时间的延续，模型组LVEF逐渐下降，LCZ696组和缬沙坦组均有所回升，小鼠心梗后第28天和第42天，LCZ696组较缬沙坦组LVEF恢复得更好(P<0.05)。见表1。

1.2 LCZ696和缬沙坦的使用可有效减轻心肌纤维化

取手术组小鼠AMI部位、对照组小鼠对应区域行Masson染色，红色代表心肌组织，蓝色指示心肌纤维化，细胞核呈蓝黑色，切片切面垂直心脏长轴。结果显示，随着时间的进展，各手术组小鼠均表现出一定程度的心肌纤维化。与模型组相比，LCZ696组和缬沙坦组心肌排列更为规整，纤维化程度更轻，特别是LCZ696组，在AMI第28、42天时，心肌纤维化的程度明显低于同一时间节点的其他手术组。见图1。

对各组小鼠的Masson染色图片进行纤维化定量分析可见，对照组心肌纤维化显著低于各手术组(P均<0.001)。自AMI后第3天开始，各手术组随着时间进程，均表现出一定程度的心肌纤维化；其中模型组最为明显，自AMI后第7天开始，其心肌纤维化比例均明显高于LCZ696组和缬沙坦组(P均<0.01)；而LCZ696组心肌纤维化比例自AMI后第14天开始出现与缬沙坦组的明显差异(P均<0.05)。见表2。

表1 各组小鼠心脏超声LVEF比较

图1 各组小鼠心肌Masson染色结果(×200)

表2 各组小鼠心肌纤维化Masson染色结果比较

3 讨论

为对抗心肌坏死引发的心肌纤维化、心室重构，改善预后，早期常规给予RAAS抑制剂已被广泛接受。欧洲心脏病学会(ESC)ST段抬高型急性心肌梗死(STEMI)管理指南明确指出，有心衰证据、左心室受损、糖尿病或前壁AMI的患者，推荐发病24 h内开始ACEI治疗，若不能耐受，可替换为ARB(Ⅰ类推荐，A级证据)[5]。基于PARADIGM-HF等一系列临床研究，全球第一个上市的ARNI类代表药物诺欣妥对抗心衰的显著作用受到广泛关注，已列为射血分数降低心衰(HFrEF)患者的Ⅰ类推荐[6]。因此，使用ARNI代替RASS抑制剂，扩充ARNI 适应证，成为心血管领域关注的焦点。目前，在AMI早期使用ACEI/ARB已成为指南推荐，但是早期使用ARNI的价值仍有待评估。

与ACEI和ARB会引起血压下降类似，在AMI时应用LCZ696可能引起血压降低的不良反应。因此，本研究在参考相关文献的基础上，选用不影响血压基线水平的最大药物剂量进行灌胃给药，缬沙坦的剂量按照LCZ696中的药物占比进行计算[7]，以避免在AMI早期因部分小鼠血流动力学不稳定而影响实验结果。另外，为了观察AMI早期小鼠心功能及心肌纤维化的动态演变过程，本研究设置了多个时间检测节点，以确保数据的全面性，更好地呈现这一动态过程。

在本研究中，随着时间进展模型组小鼠的心功能持续恶化，而缬沙坦组和LCZ696组小鼠的心功能均有所改善。模型组心功能的恶化对应在心肌Masson染色上，表现为不断扩大的心肌纤维化面积，提示心肌纤维化的发生发展在小鼠AMI后心室重构、心功能减退中扮演着重要角色。而在缬沙坦组和LCZ696组，对比同一时间节点的心肌纤维化比例和LVEF，更低的心肌纤维化比例对应着更为明显的LVEF提升，且此现象在LCZ696组更为明显，提示拮抗RASS可以在一定程度上减轻AMI急性期的心肌纤维化，而LCZ696在拮抗RASS的基础上联合了脑啡肽酶抑制剂的作用，可以更有效地对抗心肌纤维化。

LCZ696是一种新型血管紧张素受体及脑啡肽酶双效抑制剂，是由沙库巴曲与缬沙坦结合而成的盐复合物晶体，口服易吸收，生物利用度高，给药后在体内可分解为缬沙坦和AHU377，后者可快速代谢为有抑制脑啡肽酶活性的LBQ657[8-10]。缬沙坦可选择性地阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与血管紧张素1型受体(AT1)的结合，从而发挥抗RASS作用；LBQ657则可抑制脑啡肽酶，减少体内利钠肽系统(NPs)的降解，NPs通过相应的受体激活鸟苷酸环化酶(GC)，产生第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)，进而激活下游信号传导通路，起到降低血管阻力，舒张血管，对抗心肌纤维化的作用[11-12]。有研究证实，心房利钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)可通过cGMP信号通路，抑制转化生长因子-β(TGF-β)表达，进而有效对抗心肌纤维化[13-14]。此外，外源性输入C型利钠肽(CNP)亦可减轻AngⅡ介导的心肌重构[15]。小鼠AMI早期使用双效抑制剂LCZ696，抗纤维化作用明显优于单用缬沙坦。

综上所述，本研究在小鼠AMI早期使用LCZ696和缬沙坦，发现LCZ696可以获得比单用缬沙坦更好的对抗心肌纤维化、改善LVEF的效果，这为临床探索ARNI新的用药适应证提供依据。