注射用红花黄色素对大鼠股骨骨折愈合的治疗作用及机制研究

张爱新，张卓，张杰

(北京市平谷区医院急诊科，北京 101200)

红花黄色素是从红花花瓣当中提炼制成的一种可溶性查尔酮混合物，其中红花黄色素A是主要的有效成分。研究已经发现红花黄色素A具有多种医用功效，主要包括抗凝血、抗氧化、镇痛以及活血化瘀等[1-3]。目前关于红花黄色素在骨折愈合中的作用鲜有文献报道。本研究拟采用注射用红花黄色素对大鼠股骨骨折模型愈合过程进行干预，运用DR成像技术观察其对骨折愈合各个不同阶段的影响，并通过分子生物学技术观察其对骨折模型中骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)、RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2，RUNX2)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene，MYC)及细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)基因表达的影响，为红花黄色素在骨折治疗的开发及扩大其临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物为南京大学动物模式中心购买的30只8周龄的SPF雄性Sprague-Dawley大鼠，体重约为(220±20)g。将所有大鼠放置在温度为20～22℃、湿度为40%～60%、光照日/夜循环周期为12 h/d的条件下喂养，并给予足够的饮用水及饲料。动物实验已获得北京市平谷区医院医学伦理委员会同意，并严格按照国家科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.2 大鼠骨折模型构建 参考Metineren等[4]建立大鼠股骨开放骨折模型。主要步骤如下：采用2%戊巴比妥钠以0.2 mL/kg进行腹腔注射麻醉大鼠，成功后用外科剪去掉左后腿毛发、碘伏消毒，并固定于实验台上。在左膝关节髌骨前方做直行切口，纵行切开部分股四头肌腱性组织，暴露髌骨。将髌骨向内侧推开，暴露股骨髁间凹。用1.1 mm克氏针自股骨髁间凹插入，用低速医用电钻沿髓腔逆行插入，直至克氏针自股骨大转子近端穿出，确认固定可靠后，将克氏针紧贴股骨头转子根部折弯，剪除多余部分。随后用剪刀于股骨中段环形剪断，造成股骨骨折。观察骨折内固定稳定性，依次冲洗，缝合切口。麻醉苏醒后，将大鼠继续常规喂养，并给予每只大鼠肌肉注射青霉素20万IU/d，共3 d，以预防感染。

1.3 实验分组及治疗方案 将大鼠按照随机数字法分为实验组与对照组，每组15只。实验组大鼠术后第1天开始给予注射用红花黄色素(山西华辉凯德制药有限公司生产，国药准字Z20050594)，每次20 mg，将其融入到50 mL 0.9%氯化钠溶液，30～40滴/min尾静脉滴注，每天1次，持续治疗2周[5]。对照组给予等量的0.9%氯化钠注射液缓慢静脉滴注，每天1次，持续治疗2周。

1.4 DR成像技术 拍摄正侧位X线片观察骨折情况及内固定情况，拍照条件为100 mA，50 KV，球管投照距离为100 cm。利用医学影像分析软件对X线图像进行分析，计算各组平均骨痂直径，并参照文献标准[4]进行骨折愈合评分。

1.5 RNA提取 分别于手术后第2、4、8周处死大鼠，数量各5只，并获取骨痂组织。取适用骨痂样本加入1 mL TRIzol试剂，常温静置5 min。添加800 μL氯仿溶液，常温静置5 min。在4℃、12 000 g条件下离心15 min，并收集上清液。添加800 μL异丙醇，常温静置10 min。在4℃、12 000 g条件下离心10 min，丢弃上清液，保留沉淀。添加1 mL 75% 乙醇溶液，常温静置5 min。在4℃、12 000 g条件下离心5 min，丢弃上清液，保留沉淀。添加10 μL 无RNA酶去离子水溶解沉淀，静置5 min使沉淀充分溶解，将RNA定量后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.6 逆转录反应 采用无RNA酶去离子水将RNA样本浓度调定为1 μg/μL。取1 μg RNA进行逆转录合成cDNA。反应总体积为10 μL，包括RNA 1 μL、逆转录试剂5 μL和无RNA酶去离子水4 μL。反应温度条件如下：70 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，随后4℃ 5 min。将合成的cDNA放置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.7 荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试验 以合成的cDNA作为模版在Roche Light Cycler480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪上进行定量试验。扩增条件为：98 ℃ 10 min，随后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列见表1。反应体系如下：无RNase去离子水 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL及SYBR premix 8 μL。

表1 引物序列

1.8 蛋白质印迹法 提取总蛋白，通过12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)胶分离蛋白，随后将蛋白印迹转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。将膜在37 ℃条件下用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后在4 ℃条件下将膜与一抗一起孵育过夜。用Tris-盐酸Tween 20(Tris-HCl-Tween，TBST)缓冲液洗涤3次后，将膜与辣根过氧化物酶缀合(horseradish peroxidase，HRP)的二抗(1︰2 000稀释)在37 ℃条件下孵育1 h。最后，曝光胶片并检测阳性条带。

2 结 果

2.1 两组大鼠一般情况比较 实验组15只大鼠，1只死亡，14只成活并成功建立骨折模型。对照组15只大鼠均成功建立骨折模型，未发生死亡。所有大鼠术后第1天均能自如活动，正常进食及饮水。术后1周伤口红肿情况逐渐消退，无渗液。

2.2 两组大鼠骨折愈合情况比较 实验组大鼠术后第1周手触骨折部位发现局部突起增生明显；而对照组大鼠局部手触感空虚，增生不明显。实验组术后第2周可见到清晰的骨痂形成；而对照组大鼠骨折处未见骨痂生长，仅有骨膜反应。两组大鼠术后第4周可见到骨痂形成，实验组骨缺损模糊，骨缺损被骨痂填满且周围有大量外骨痂形成，骨痂密度较对照组为高；而对照组骨缺损处可见低密度骨痂填充，无外骨痂。实验组大鼠术后第8周骨缺损消失，骨皮质重建，骨干外形已恢复，骨髓腔已通；而对照组仍可见到模糊的骨缺损，缺损区已被骨痂填满，有少量外骨痂，髓腔未通。实验组大鼠术后第8周骨痂生成质量、速度、阴影密度均高于对照组(见图1a)。实验组大鼠骨折愈合评分明显优于对照组，差异有统计学意义(见图1b，P<0.05)。

a DR摄片 b 骨折愈合评分

2.3 两组大鼠骨痂组织中BMP-2、BMP-7及RUNX2基因表达量比较 实验组大鼠骨痂组织中BMP-2、BMP-7及RUNX2基因mRNA及蛋白术后第2、4、8周的表达量均高于同时间点对照组，差异有统计学意义(见图2，P<0.05)。BMP-2、BMP-7和RUNX2基因mRNA及蛋白在实验组大鼠术后第4周及第8周骨痂组织的表达量均高于术后第2周，且在术后第4周的表达量达到巅峰(P<0.05)。

2.4 两组大鼠不同时间点骨痂组织中MYC及CCND1基因表达量比较 实验组大鼠骨痂组织中MYC及CCND1基因mRNA及蛋白术后第2、4、8周的表达量均高于同时间点对照组，差异有统计学意义(见图3，P<0.05)。MYC及CCND1基因mRNA及蛋白在实验组大鼠术后第2、4、8周骨痂组织中的表达量呈上升趋势，且术后第8周的表达量达到巅峰(P<0.05)。

3 讨 论

研究表明，红花黄色素与红花的药理作用基本一致，其活血消肿机制是通过调控电压依赖性Ca2+通道减少Ca2+内流，舒张血管平滑肌[6]；同时红花黄色素亦可产生抗血小板活化因子，保护内皮细胞[7]。最近研究结果发现，红花黄色素还可抑制血小板激活因子介导的血小板聚集，通过清除羟自由基而抑制抗凝血酶Ⅲ分子的解聚作用，从而缓解血凝状态，促进血液循环，缓解肢体肿胀[8]。正因如此，红花黄色素在骨科临床多用于术后患者的辅助治疗。目前，关于红花黄色素在骨折愈合中的治疗作用鲜有文献报道。本研究拟采用注射用红花黄色素对大鼠股骨骨折模型愈合过程进行干预，运用DR成像技术观察其对骨折愈合各个不同阶段的影响及可能的作用机制。结果发现，给予注射用红花黄色素处理的大鼠术后第2、4、8周骨折的愈合速度、愈合质量、骨痂的密度均高于对照组，表明注射用红花黄色素可通过加快骨痂形成速度、提高骨痂的密度和质量以促进骨折的愈合。

骨形成是指未分化的前体细胞在损伤发生后趋化集中到损伤部位，在特定生长因子的刺激作用下最终分化为成骨细胞，通过合成胶原形成新的健康骨组织的过程[9-10]。研究证明，BMP-2是诱导成骨分化的重要细胞因子，在促进骨折愈合以及调节骨缺损修复等方面有着重要的作用[11-12]。BMP-7能够将骨髓间充质前体细胞经过诱导转化为成熟的成软骨细胞以及成骨细胞[13-14]。本研究发现，BMP-2和BMP-7在实验组大鼠术后第2、4、8周骨痂组织中的表达量较对照组明显升高，说明注射用红花黄色素可诱导BMP-2和BMP-7相关信号转导通路激活。RUNX2具有很强的诱导成骨的活性，能够诱导异位骨形成，促进成骨细胞的增殖分化以及碱性磷酸酶的表达[15-16]。实验组中RUNX2表达量较对照组明显上升，说明注射用红花黄色素可诱导成骨细胞增殖活化。术后第8周时，实验组BMP-2、BMP-7及RUNX2仍然较对照组高，但是相较第4周时的表达水平已经下降，这主要由于此时骨折愈合已趋完成所致。

a BMP-2 b BMP-7 c RUNX2 d 蛋白

a MYC b CCND1 c 蛋白

越来越多的文献证实，Wnt/β-catenin信号通路对骨量的调控具有重要作用[17-18]。Wnt/β-catenin信号通路主要组分包括：细胞外配体、糖原合成酶激酶-3、七次跨膜受体蛋白、胞质内β-连环蛋白(β-catenin)及细核内转录因子等。研究表明，当在间充质干细胞及成骨细胞中下调β-catenin的表达水平都会导致低骨量形成，而上调β-catenin水平将增加骨量形成[19-20]。MYC及CCND1基因是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分。本研究发现注射用红花黄色素可以明显升高骨痂组织中MYC及CCND1基因表达量，并呈上升趋势，以术后第8周时为最高，与骨折愈合分期对应即晚期>中期>早期，表明注射用红花黄色素可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路而发挥促进骨折愈合的作用。

综上所述，本研究发现注射用红花黄色素促进大鼠股骨骨折愈合，其作用机制可能与上调骨痂组织中BMP-2、BMP-7、RUNX2、MYC及CCND1基因表达相关。