ESR1基因多态性与膝骨关节炎患病风险的相关性研究

鲍亮，张兵，赵晨，刘琮，朱鹏，周涛

(西安医学院第二附属医院骨外科，陕西 西安 710038)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以关节软骨破坏、关节滑膜增生、软骨下骨硬化为主要病理特点的运动系统常见多发病[1]，X线表现为软骨下骨质致密、关节间隙变窄、骨小梁断裂等，临床表现为膝关节畸形、膝关节疼痛、膝关节肿胀、活动受限等[2]。随着人口老龄化及生活方式的改变，膝骨关节炎发病率逐年攀升，成为导致我国50岁以上男性丧失劳动能力的第二大疾病[3]。目前膝骨关节炎致病机制尚不明确，近年来国内外越来越多学者关注基因变异在膝骨关节炎中的作用。有研究发现白细胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等基因变异在膝骨关节炎发病过程中具有促进作用，IL-1β、TGF-β1基因变异可增加膝骨关节炎患病风险[4-5]。有研究认为[6]雌激素受体α(estrogen receptor 1，ESR1)基因变异可能增加膝骨关节炎发生率，但ESR1基因多态性与膝骨关节炎患病风险的具体相关性尚不清楚。因此，本研究就ESR1基因多态性与膝骨关节炎患病风险的相关性进行了相关探讨，以期为膝骨关节炎早期诊断与及时治疗提供新的方向，现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 经我院伦理委员会审查批准，选择我院2017年12月至2019年4月收治的KOA患者87例作为研究组，同期在我院健康体检者87例作为对照组。入选标准：(1)KOA符合《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》中相关诊断标准[7]；(2)近3个月内未服用相关治疗药物；(3)心、肝、肾功能正常；(4)所有患者及家属对本研究充分知情。排除标准：(1)合并有严重精神系统疾病；(2)继发性骨关节炎，如类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、感染性关节炎、痛风性关节炎等；(3)合并代谢性疾病或内分泌系统疾病；(4)合并系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。研究组：男性61例，女性26例；年龄42～80岁，平均年龄(62.15±8.02)岁。对照组：男性60例，女性27例；年龄40～79岁，平均年龄(63.47±7.93)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 两组一般资料比较

1.2 研究方法 抽取两组外周静脉血4 mL，置于含肝素抗凝的无菌真空采血管(陕西奇林医疗器械有限公司)中，采用DNA提取试剂盒(洛阳吉恩特生物科技有限公司)提取DNA，微量紫外分光光度计(美国DeNovix公司)进行DNA定量，取DNA为模板，加入ESR1引物(上游引物5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，下游引物5′-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3′)、TaqDNA合成酶(西安齐岳生物科技有限公司)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增。PCR反应体系：10×Ex TaqBuffer5 μL，10 mmol/L引物各1.0 μL，25 mmol/L MgCl 4μL，2.5 mmol/L dNTP混合液4.5 μL，5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL，80～200 ng DNA模板，加水至50 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性20 s，75℃退火延伸1 min，循环35次。取10 μL ESR1 PCR产物，加入限制性内切酶Xbal、Pvu Ⅱ消化4 h，酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳下分析ESR1酶切产物，与标准DNA Marker比对。

2 结 果

2.1 ESR1基因PCR产物限制性酶切结果 PCR产物经限制性内切酶Xbal消化可形成AA、AG、GG基因型(见图1a，其中1为AA基因型，2、3、6为GG基因型，4、5为AG基因型)；PCR产物经限制性内切酶Pvu Ⅱ消化可形成TT、TC、CC基因型(见图1b，其中1、2、5、6为CC基因型，3、4为TC基因型，7为TT基因型)。

2.2 两组ESR1基因型和等位基因的分布情况 研究组ESR1基因Xbal位点的AA、AG、GG基因型频率较对照组差异有统计学意义(P<0.05)，研究组ESR1基因Pvu Ⅱ位点的TT、TC、CC基因型频率较对照组差异有统计学意义(P<0.05)，研究组ESR1基因Xbal位点的A、G等位基因频率较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。研究组ESR1基因Pvu Ⅱ位点的T、C等位基因频率较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。ESR1基因Xbal位点的AG基因型与KOA高风险发病率显著相关(P<0.05)，ESR1基因Pvu Ⅱ位点的TC基因型与KOA高风险发病率显著相关(P<0.05，见表2)。

a Xbal位点酶切结果 b Pvu Ⅱ位点酶切结果

表2 两组ESR1基因型和等位基因分布情况[例(%)]

2.3 两组ESR1基因单体型分析 研究组TG单体型分布频率较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，研究组CG单体型分布频率较对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，研究组TA单体型分布频率较对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，CA单体型在研究组中分布频率显著高于对照组(P<0.05)。单体型CA与KOA高风险发病率显著相关(P<0.05，见表3)。

表3 两组ESR1基因单体型分析[例(%)]

3 讨 论

膝骨关节炎是由于膝关节局部损伤、炎症或慢性劳损引起膝关节软骨变性及活动障碍的退行性骨关节病，好发于40岁以上的中老年人群。其病理过程复杂，遗传因素、肥胖、炎症、超负荷活动、关节应力平衡失调、骨质疏松等均与膝骨关节炎的发生相关。另有研究发现[8-9]，IL-1β-511 TC基因型人群对膝骨关节炎的易感性可能增加，携带TGF-β1-509位点CC基因型患膝骨关节炎风险高。由此可见基因变异在膝骨关节炎发病过程中扮演重要角色。

已有研究证实[10]膝骨关节炎的发生与雌激素调节有一定联系，雌激素受体α基因多态性与女性膝骨关节炎发病有关。雌激素是一种小分子类固醇激素，由雌性动物卵巢和胎盘分泌产生。雌激素具有广泛而重要的生理作用：(1)雌激素可通过作用于子宫内膜而参与人体生殖系统的调节。(2)雌激素可通过调节胆固醇代谢而减少细胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)形成，从而保护心脑血管。(3)雌激素可通过调节海马中神经分化来影响中枢神经系统发育。(4)雌激素可抑制破骨细胞分化，增加肠道钙吸收，以此调节人体骨骼系统。而雌激素在体内生理作用主要是通过雌激素受体(estrogen receptor，ESR)的介导来实现的，ESR主要分布在子宫、骨骼、膀胱、乳房、尿道、皮肤、大脑，包括位于细胞核内的ESRα(ESR1)、ESRβ(ESR2)，它们在机体内的分布具有组织/细胞特异性，可通过结合靶基因上的雌激素应答元件(estrogen response element，ERE)而发挥“基因型”调节效应，还可参与生殖、学习、记忆、认知等方面的调节[11]。Xbal、Pvu Ⅱ是ESR1基因最常见的两个多态性位点，均分布于第1内含子上，Xbal存在A和G的变异，Pvu Ⅱ存在碱基T和C的变异，这些变异可能影响ESR1功能[12-13]。有学者发现[14]ESRl数量增多会使雌激素对受体感受性增加从而导致乳腺增生症(mammary hyperplasia，HDB)发生。另有研究发现[15]ESRl基因存在高度遗传多态性，且ESRl基因Xba I位点的变异会影响ESRI转录活性，从而影响雌激素对乳腺细胞的作用。本研究分析了87例KOA患者和87例健康体检者的ESR1基因Xbal、Pvu Ⅱ的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，结果显示研究组ESR1基因Xbal位点的AA、AG、GG及Pvu Ⅱ位点的TT、TC、CC基因型频率较对照组有显著差异，说明ESR1基因多态性可能与KOA发生相关。进一步采用非条件logistic回归分析基因型与KOA之间的关联性，结果显示ESR1基因Xbal位点的AG基因型及Pvu Ⅱ位点的TC基因型与KOA高风险发病率显著相关，提示ESR1基因Xbal位点的AG基因型及Pvu Ⅱ位点的TC基因型分布频率越高KOA患病风险可能越大。本研究单体型分析显示CA单体型在研究组中分布频率显著高于对照组，单体型CA与KOA高风险发病率有一定关联，提示单体型CA可能引起KOA发生。

综上所述，ESR1基因多态性与膝骨关节炎发病有一定联系，ESR1基因突变可能会增加膝骨关节炎患病风险。该研究结果有助于阐明膝骨关节炎分子遗传学机制，为在基因水平上预测个体发病风险提供一定参考依据。但除了ESR1基因Xbal、Pvu Ⅱ位点外，ESR1基因还存在其他多态性位点协同影响KOA发生，故需结合ESR1基因其他位点作进一步研究。