富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1（LRIG1）基因在非小细胞肺癌中的表达、信号通路及其与预后的关系

黄 鑫， 滑 峰

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因，吸烟被认为是主要的危险因素，吸烟者占所有肺癌患者的70%～90%[1]。虽然肺癌的发病机制复杂，并受多因素影响，但环境和遗传因素在肺癌的发病中起重要作用[2]。

肺癌主要分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC起源于神经内分泌细胞，约占所有原发性肺癌的15%。NSCLC一般起源于支气管或肺泡细胞，是最常见的原发性肺癌。肺癌患者预后较差，5年生存率较低，重要原因是大多数肺癌患者确诊时已发展至晚期，往往不能通过手术切除达到治愈的目的[3]。因此，探寻NSCLC患者预后的影响因素，是目前NSCLC的研究热点。既往认为，NSCLC的临床分期、病理类型是影响患者生存期的重要因素[4]。近年来随着分子生物学技术的不断发展，众多肿瘤预后影响因子被发现。近年来研究显示，富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1（LRIG1）基因高表达可能与肿瘤的预后较好有关[5]。而LRIG1在NSCLC中的研究鲜有报道，其与NSCLC预后的关系不清。本研究首先采用生物信息方法分析LRIG1基因在NSCLC中的表达、相关生物学功能及其与患者生存期的关系，然后采用免疫组织化学法检测96例NSCLC组织标本，对生物信息分析结果进行验证。

1 资料与方法

1.1 LRIG1表达水平分析 检索癌症基因组图谱（TCGA）数据库，对比各组织及人体各种恶性肿瘤中LRIG1基因的mRNA表达水平。检索分析条件为“肺癌” “非小细胞肺癌” “肺鳞癌”“肺腺癌”“LRIG1”，物种为人类。

1.2 LRIG蛋白-蛋白相互作用网络 应用蛋白相互作用（STRING）数据库构建LRIG1蛋白相互作用的蛋白-蛋白网络，LRIG1蛋白-蛋白相互作用网络构建条件为置信度大于0.9，相互作用来源为共表达、基因功能和比邻关系[6]。

1.3 LRIG1基因功能富集 对LRIG1基因相互作用蛋白功能进行富集，富集包括生物学过程、分子功能和细胞成分。分别计数上述过程的基因数量和背景基因数量及其P值。富集过程应用在线分析软件WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit进行[7]，富集条件为基因计数不少于3个，P<0.05。

1.4 免疫组化检测LRIG1蛋白表达 选取在我院手术治疗的NSCLC患者96例，应用免疫组织化学法按试剂盒操作说明检测NSCLC患者癌组织和癌旁组织中LRIG1蛋白表达水平，探讨其表达与NSCLC患者临床病理特征的关系。

1.5 LRIG1蛋白高低表达判断 在显微镜下随机选取3个高倍视野进行观察。染色强度评分：不着色(0分)、浅黄(1分)、棕黄(2分)、棕褐色(3分)；阳性细胞比例评分：阳性<10%(0分)；阳性10%～25%(1分)；阳性26%～50%(2分)；阳性51～75%(3分)及阳性>75%(4分)。总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度评分。最终评判：<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.6 统计学方法 采用软件GEPIA进行在线分析，定量数据采用表示，组间比较采用F检验；计数资料采用例（%）表示，比较采用卡方检验，依据LRIG1基因mRNA在癌组织中表达的中位数将本组患者分为高表达组、低表达组，绘制两组患者生存曲线，log-rank检验比较两组总生存期和无疾病进展生存期，P<0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 LRIG1基因表达 在TCGA数据库中，胰腺、脑皮质和直肠等组织中LRIG1基因表达水平较高，而在骨髓、淋巴细胞和胸腺等组织中表达水平较低，图1A；在肿瘤患者中，LRIG1基因在子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌中表达水平较高，图1B；在NSCLC组织中，LRIG1基因在癌旁正常组织中表达水平较高，而在癌组织中表达较低，图1C。

图1 不同组织中的LRIG1基因mRNA表达水平比较

2.2 LRIG1蛋白-蛋白相互作用 应用STRING数据库建立与LRIG1蛋白相互作用的蛋白-蛋白相互作用网络，选取了与LRIG1蛋白相互作用较为紧密的10个基因编码蛋白10个，蛋白间相互作用关系edge=45，区域聚类指数为0.874，与LRIG1蛋白相互作用较为紧密的10蛋白相互作用网络富集显著（P<0.001），见图2。

图2 与LRIG1蛋白相互作用网络信号通路网络

2.3 LRIG1基因共表达 TCGA数据库中对LRIG1基因共表达基因进行了分析[8]（图3），其中CACNA1D基因与LRIG1基因正向共表达最为明显（r=0.51，P<0.05），而RGS20基因与LRIG1基因负向共表达最为明显（r=–0.49,P<0.05），图4。

图3 LRIG1基因共表达分析

图4 LRIG1共表达正负相关基因散点图

2.4 功能富集 LRIG1基因生物学过程、细胞成分和分子功能主要分别富集于表皮生长因子受体信号通路的负调控、胞质囊泡部和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性等，见表1。

表1 LRIG1及其共表达基因相关生物学过程

2.5 京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路 LRIG1基因相关信号通路主要富集于癌症中的蛋白多糖、内吞作用、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、RAP1信号通路、癌症的途径和ras信号通路等，见图5。

2.6 生存分析 LRIG1基因mRNA高表达组患者的总生存期高于低表达组（HR=0.74,P<0.05），而两组的无疾病进展生存期差异无统计学意义（HR=1.0,P=0.97），见图 6。

2.7 LRIG1蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 LRIG1蛋白主要表达在细胞浆，阳性表达呈现棕褐色颗粒，均匀分布[9]，图7。LRIG1蛋白在NSCLC癌组织的阳性表达率为57.3%（55/96），低于癌旁正常组织中的81.3%（78/96）（P<0.05）。LRIG1蛋白高表达与NSCLC患者临床分期、肿瘤大小和纵隔淋巴结转移有关（P<0.05），见表2。

图5 LRIG1及相关基因KEGG信号通路气泡图

图6 LRIG1基因mRNA表达与非小细胞肺癌患者总生存期和无疾病进展生存期的关系

图7 免疫组化检测LRIG1蛋白在NSCLC癌组织和癌旁正常组织中的表达情况

表2 LRIG1蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

3 讨论

人类富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域（LRIG）基因家族由LRIG1、LRIG2、LRIG共3个基因组成[10]。以往多项研究表明LRIG1可能在人类癌症中起到抑癌作用。LRIG1与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用，增强其配体刺激的泛素化和降解[11-12]。因此，LRIG1负性调节EGFR，并增加膀胱癌和食管癌对铂类抗癌药物的敏感性。在皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌、宫颈癌及口咽癌中，高LRIG1表达与患者预后较好有关，并与更长的无病生存期和（或）总生存期相关[13]。

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的主要原因，每年占新增病例13%和死亡病例18%的肺癌被诊断为NSCLC，占所有肺癌病例的80%以上[14]。LRIG1在肺癌中的研究报道较少，LRIG1蛋白在正常人肺细胞中有表达，但与相应的正常组织相比，某些肿瘤细胞株的LRIG1表达下调。而LRIG1在肺癌患者组织中表达及其与患者临床病理特征和预后的关系研究报道较少。

An等[15]采用定量聚合酶链反应和免疫组化法证实LRIG1 mRNA及蛋白在NSCLC患者中的表达与肿瘤的病理类型、分化程度和分期有关。生存分析显示LRIG1是NSCLC患者总生存期的独立影响因素，LRIG1高表达患者预后较好。而房艳红等[16]研究显示LRIG1基因高表达患者的临床分期较晚，预后不良。因此LRIG1与NSCLC患者临床特征及预后的关系存在争议。本研究发现LRIG1mRNA在癌组织中的表达水平低于癌旁组织，与LRIG1在肺癌细胞系中的研究结果一致。且LRIG1蛋白高表达与NSCLC患者临床分期、肿瘤大小及纵隔淋巴结转移有关。LRIG1高表达患者的总生存期较长。

综上，LRIG1在NSCLC患者癌组织中呈高表达并可作为NSCLC患者预后较好的分子标志物。同时，上调NSCLC患者LRIG1基因表达水平，可能成为NSCLC靶向药物研发的方向。