CD157/BST1基因多态性与孤独症谱系障碍发生风险关系研究*

何美玲 张 丽 徐建坤 张林霞

孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是一种神经发育障碍性疾病，是儿童精神类疾病中最严重的一种，一般男童患病率是女童的4～5倍，患病儿童表现出社会交流障碍、语言交流障碍和重复刻板行为，严重危害儿童身心健康[1]。ASD病因目前尚未完全阐明，临床治疗仍以特殊教育训练为主，但若诊断或干预治疗不及时会导致ASD伴随患儿一生，严重影响患儿成年后生活质量，这在重症ASD患儿中尤为突出[2]。因此阐明ASD易感因素对早期诊断、预防及治疗ASD具有十分重要的临床意义。CD157也称为骨髓基质抗原1(Bone Marrow Stromal Antigen1，BST1)，已被证实作为一种信号分子在人粒细胞极化、迁移、分裂中起重要作用，参与多种疾病发病机制[3]。近年来研究表明，CD157/BST1基因多态性与帕金森发病有关，CD157/BST1基因缺陷小鼠表现出焦虑相关抑郁样行为，提示CD157/BST1基因可能与神经异常性疾病有关[4,5]。本研究在前人研究基础上，分析CD157/BST1基因rs4301112位点单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)与ASD患儿病情严重程度及发生风险的关系。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年4月～2019年11月在濮阳惠民医院就诊的102例ASD患儿作为研究组，ASD诊断由两位经验丰富的儿童精神病学专家通过对受试儿童父母访谈和对受试儿童行为观察进行确诊，均符合美国精神障碍诊断与统计手册第五版(DSM-V)中ASD诊断标准[6]；排除智力发育障碍、儿童精神分裂症、婴儿痴呆(Heller综合征)、埃斯博格综合征(Asperger综合征)等其他全面发育障碍及社会心理因素、耳聋等所引起的类似ASD症状。另选择100名无精神发育迟滞、注意缺陷多动障碍、抽动障碍等神经发育障碍的儿童志愿者为对照组。排除合并全身其他系统疾病儿童。研究组102例ASD患儿中，男59例，女43例，平均年龄(11.68±2.64)岁，出生时母亲年龄(29.17±1.38)岁，剖宫产61例(59.80%)，母亲接受高中以上教育80例(78.43%)；对照组100名儿童志愿者中男55名，女45名，平均年龄(12.11±2.78)岁，出生时母亲年龄(28.86±1.29)岁，剖宫产57名(57.00%)，母亲接受高中以上教育86名(86.00%)。两组儿童性别、平均年龄、出生时母亲年龄、剖宫产及母亲接受高中以上教育等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得受试儿童家属同意并签署知情同意书，经濮阳惠民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 儿童孤独症评定量表(Child Autism Rating Scale，CARS)评分及分组 使用CARS对ASD患儿病情进行评定[7]，CARS包括人际关系、模仿行为、情感反应、奇异的身体动作或仪式化的行为、视觉反应、听觉反应、智力功能等15项内容，每项内容包括：正常(1分)表示儿童行为在该年龄段儿童中属于正常，轻微不正常(2分)表示儿童行为与同龄期儿童相比轻微不正常，很不正常(3分)和极度不正常(4分)4个评分项。评分标准：总分<30分表示无ASD；30～37分有轻到中度ASD；38～60分有重度ASD。根据CARS评分结果，将102例研究组患儿分为轻中度组66例，重度组36例。

1.2.2 CD157/BST1基因位点rs4301112基因型检测 采集受试儿童肘静脉血2 ml，加入EDTA抗凝，使用血液DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取血液样本基因组DNA，使用UV-1800紫外可见分光光度计(上海岛津实验器材有限公司)检测基因组DNA浓度及A260/A280值，并调整DNA浓度为50 ng/μl。以1 μl血液样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增CD157/BST1基因位点rs4301112片段，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共45个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。2.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收纯化目的基因。采用Sanger测序法进行测序，应用软件GeneMapper4.0分析CD157/BST1基因位点rs4301112的SNP。

1.2.3 统计学方法 应用统计学软件SPSS 24.0分析数据，对基因型和等位基因分布频率进行Hardy-Weinberg平衡检验，计数资料用百分数表示，组间比较行χ2检验或Fisher精确检验，计量资料用平均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，采用Logistic回归模型分析不同基因型与ASD发病风险的关系，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD157/BST1基因位点rs4301112基因型及等位基因分布频率 两组CD157/BST1基因位点rs4301112基因型及等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有代表性。研究组AA基因型分布频率低于对照组(P<0.05)，AG基因型分布频率高于对照组(P<0.05)；两组等位基因分布频率比较差异存在统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 CD157/BST1基因位点rs4301112基因型及等位基因分布频率[n(%)]

2.2 CD157/BST1基因位点rs4301112隐性/显性基因型分布频率 显性模式下，两组基因型分布频率比较差异存在统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 CD157/BST1基因位点rs4301112基因型分布与ASD严重程度关系 重度组AA基因型分布频率低于轻中度组(P<0.05)，AG基因型分布频率高于轻中度组(P<0.05)；轻中度组和重度组等位基因分布频率比较差异存在统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 CD157/BST1基因位点rs4301112基因型分布与ASD严重程度关系[n(%)]

2.4 CD157/BST1基因位点rs4301112多态性与ASD发生风险的关系 通过将AA、GG、AG+AA、AG+GG基因型以及年龄、出生时母亲年龄、母亲受教育年限、剖宫产等因素作为自变量，以是否发生ASD作为因变量进行多因素回归分析，发现AG+GG基因型是ASD发生的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 CD157/BST1基因位点rs4301112多态性与ASD发生风险的关系

3 讨论

据报道，近年来儿童ASD患病率呈逐年上升趋势，早期未经及时诊断、干预治疗的患儿具有较高终身残疾率[8]。目前关于引起ASD的原因尚未完全阐明，普遍认为其可能是由遗传、病毒感染、孕产期危险因素等多种因素造成的特定脑结构或脑功能损伤所致[9,10]。近年来，随着全基因组测序技术的发展，多项证据证实，基因SNPs与ASD易感性有关[11,12]。

CD157最初被发现在类风湿关节炎患者骨髓基质细胞系中表达增强，是一种支持前B细胞生长的细胞表面分子[13]。以往CD157功能研究多集中在炎症和免疫系统，证实CD157/BST1在体液免疫反应、中性粒细胞迁移和造血干细胞支持中发挥多种作用，其还参与各种疾病的发病机制，如类风湿性关节炎中B淋巴细胞存活，白血病进展和人卵巢癌细胞转移[14,15]。近年来越来越多的研究表明，人类染色体4p15上CD157/BST1基因的SNP是帕金森病的危险因素，证实CD157可能在胚胎和成人神经系统中发挥作用[16]。但CD157/BST1基因多态性与ASD的关系研究尚不多。Shigeru Y等[17]检测CD157/BST1基因的93个SNP与ASD的关系，发现rs4301112和rs28532698位点SNP可能与ASD易感性有关。本研究结果证实，研究组AA基因型分布频率低于对照组，AG基因型分布频率高于对照组，两组等位基因分布频率比较差异有统计学意义，提示CD157/BST1基因rs4301112位点遗传变异可能与ASD发生有关。进一步分析发现，显性模式下，研究组和对照组基因型分布频率比较差异有统计学意义，而隐性模式下两组基因型分布频率比较差异无统计学意义，与Shigeru Y等[17]支持隐性模型不同，这可能与地理环境因素有关。

ASD的临床干预治疗越早越好，尤其对程度较严重的ASD患儿，2岁时给予及时干预会有较好的成效，但超过3岁后干预治疗效果较差，可能会导致ASD伴随终生，给家庭带来严重精神和经济负担。BST1是一种糖基磷脂酰肌醇，在细胞膜外锚定核糖环化酶催化环化腺苷二磷酸核糖生成，是维持细胞内Ca2+稳态的重要因子[18]。研究表明，Ca2+稳态失衡可导致多巴胺能神经元变性，且Ca2+对突触前膜释放神经递质等神经元电活动至关重要[19,20]。本研究发现，重度组AA基因型分布频率低于轻中度组，AG基因型分布频率高于轻中度组，轻中度组和重度组等位基因分布频率比较差异存在统计学意义，说明不同严重程度的ASD患儿在同一基因位点的基因型分布可能不同，患儿间具有较强异质性。因此，检测CD157/BST1基因位点rs4301112基因型分布还可能有助于鉴别ASD严重程度，对改善ASD神经系统发育、改善患儿预后十分重要。本研究Logistic回归模型分析显示，CD157/BST1基因rs4301112位点AG+GG基因型是ASD发生的危险因素，提示CD157/BST1基因变异可能诱导或加重ASD发生。这可能与CD157/BST1基因变异破坏神经元结构和功能完整有关。

综上所述，CD157/BST1基因rs4301112位点AG+GG基因型与ASD发生风险及病情严重程度有关。但本研究存在样本量较小，未考虑环境因素等不足，此外未考虑基因SNPs与环境和人群种族差异关系。因此，CD157/BST1基因多态性与ASD的关系还需进行大样本量、多中心的研究证实。