精神分裂症患者外周血调节性T细胞与其相关细胞因子的变化及意义*

刘 恋 胡晓华 段 铱

精神分裂症是一种常见的重性精神疾病，以精神活动与环境不协调为主要特征，具有感知觉、思维、情感等多方面的障碍，人群总患病率为1%，多起病于青春期，病程迁延，致残率高。精神分裂症的病因和病理机制研究涉及多个领域，包括遗传、环境影响、内分泌代谢紊乱、病毒感染等等，但至今尚无定论。最新研究发现脑膜中存在淋巴管，是免疫细胞进出中枢神经系统的重要途径[1]。此发现为精神分裂症存在免疫功能异常的假说提供了理论基础。研究显示, 在某些精神分裂症患者的脑脊液、神经组织和外周组织液中, 存在炎症反应和不同类型自身免疫反应相关的生物学指标异常。而一些自身免疫系统疾病患者发生精神分裂症的风险也有所增加或可伴发精神症状[2]。目前国内外的研究绝大部分集中在T、B细胞总数、细胞亚群比值及某些细胞因子变化的研究，且研究结果很不一致。通过深入研究，自身免疫疾病的发生都与一种重要的具有免疫抑制作用的调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)亚群有关[3～5]。这种Treg细胞的缺少，可以导致器官特异性或非器官特异性的自身免疫疾病，而增加这种Treg细胞体内的数量可以有效的预防或延缓这些疾病的发生[6]。本研究通过研究精神分裂症患者急性发作和病情缓解状态下，Foxp3+Treg细胞亚群的数量、功能的变化以及与之相关的细胞因子白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-6(IL-6)表达的变化，以探讨精神分裂症患者的免疫失衡与疾病发生、发展间的关联。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2013年6～10月在武汉市精神卫生中心住院治疗的首次发作、未经药物治疗的患者。全部病例均为符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-IV)诊断标准的精神分裂症患者22例，为排除抗精神病药物对免疫系统直接或间接的影响，所有病例均为首发、未经药物治疗的患者，且急性期(入院第1天)临床评定阳性和阴性综合征量表(Positive and Negative Syndrome Scale, PANSS)总分≥70分，且≤120分，缓解期(经治疗4周后)PANSS总分减分率>25%。所有病例中男11例，女11例，年龄18～50岁，平均年龄(26.82 ±7.42)岁，病程1～24个月，平均病程(10.09±9.47)个月。所有病例均排除脑器质性、躯体和免疫系统的疾病，无物质滥用史，无过敏史。本研究经伦理审查委员会批准(KY2017.21)，所有受试者签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 评定方法 采用PANSS量表评估患者病情严重程度及治疗后的缓解程度。分别于入院第1天及治疗28天后对患者进行评分，由两名经过PANSS量表一致性培训的医师(Kappa=0.92)，通过询问病情、精神检查、完成入组资料的收集和对精神分裂症患者的PANSS量表的评定。并分别于急性期及缓解期两次采集外周血并进行检测。血样使用含3.8%柠檬酸钠的抗凝真空管采集后，冰盒中运输，4℃保存，在2 h内处理，用于分离外周血单个核细胞。

1.2.2 CD4+Foxp3+Treg细胞测定

1.2.2.1 分离各组PBMC，采用荧光标记的抗CD4、Foxp3的抗体进行细胞膜表面染色 (1)使用含0.5%FBS的PBS重悬PBMC，调整细胞浓度为1×107个/毫升；(2)设置流式管，每管加入100 μl PBMC悬液(1×106个细胞)，分别加入anti-human CD3 FITC、anti-human CD4 PECy7、anti-human CD25 APC流式抗体2 μl，混匀；(3)置于4 ℃冰箱中，避光，孵育30 min；(4)直接加入PBS 1 毫升/管，500 g×5 min，弃上清；(5)PBS重悬细胞，清洗1遍，500 g×5 min，弃上清。

1.2.2.2 细胞内染色 (1)将4×Fixation/Permia-bilization Buffer(固定/破膜缓冲液)以Diluent稀释至1×，取1 毫升/管重悬细胞，置于4 ℃冰箱中，避光，静置40 min，进行固定与破膜；(2)将10×Perm Buffer(破膜缓冲液)以双蒸水稀释至1×；(3)细胞固定破膜后离心，500 g×5 min，弃上清；(4)Perm buffer洗1次，弃上清；(5)以100 μl Perm Buffer重悬细胞，于Foxp3单标管和Treg测量管中加入anti-human Foxp3 PE流式抗体2 μl，置于室温，避光，孵育30 min；(6)直接加入Perm Buffer 1 毫升/管，500 g×5 min，弃上清；(7)Perm Buffer重悬细胞，清洗1遍，弃上清；(8)用PBS 300 μl重悬细胞，流式上机检测；(9)设置淋巴细胞门，并进一步设置CD4门，分析CD4+T细胞(CD4+)和Treg细胞(CD4+Foxp3+)。

1.2.2.3 RT-PCR技术检测患者急性期、缓解期Foxp3+、IL-6、IL-10、TGF-β mRNA的表达水平 分离CD4+T细胞进行RNA制备。RT-PCR反应体系：THUNDERBIRD SYBR©qPCR Mix 7.5 μl；Forward Primer 0.5 μl；Reverse Primer 0.5 μl；cDNA 1 μl；Nuclease free water up to 15 μl。反应条件：预变性95 ℃ 10 min；两步循环；变性 95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 30 s；循环数 40。Real time PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成，引物序列见表1。用2-ΔΔCT法(比较CT 法)对荧光定量PCR的结果进行相对定量分析：基因相对表达量=2-平均ΔΔCT。

表1 引物序列

2 结果

2.1 患者治疗前后PANSS评分比较 患者治疗前急性期PANSS总分为(74.16±8.24)分，治疗后缓解期PANSS总分为(48.68±11.88)分，治疗后PANSS总分较治疗前降低(t=7.7,P<0.05)。

2.2 患者急性期与缓解期CD4+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞比例 通过流式细胞仪分析发现，精神分裂症患者急性期外周血CD4+Foxp3+Treg细胞百分率[(6.46±2.02)%]低于缓解期[(8.50±1.93)%](t=3.426,P<0.05)。

2.3 患者Treg细胞比例与PANSS评分、病程相关性分析 采用Pearson相关分析，Treg细胞比例与急性期PANSS评分无相关性(r=0.288，P=0.238)。Treg细胞比例与病程也无相关性(r=0.028，P=0.911)。

2.4 患者急性期与缓解期Foxp3、IL-6、IL-10、TGF-β mRNA表达水平比较 精神分裂症患者缓解期的Foxp3 mRNA较急性期上调(P<0.01)，缓解期的IL-6 mRNA较急性期下调(P<0.01)。见表2。

表2 急性期与缓解期Foxp3及相关细胞因子mRNA表达差异

3 讨论

近来，有学者认为机体免疫功能失调可能是精神分裂症的重要病理学机制，慢性复杂的炎性过程引发神经发育障碍，至少是一个特殊亚型；血清或血浆免疫分子的研究也支持这一亚型存在，相关免疫分子很可能成为其神经免疫学标记物[7]。

Treg细胞在机体急性感染、慢性炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要作用，对机体中自身反应性T细胞和部分效应性T细胞的选择性抑制是Treg细胞形成和维持免疫自稳的重要机制之一。Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能,通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫细胞的增殖与活化,在抗原浓度低时, Treg细胞通过细胞接触发挥作用；而在抗原浓度高时该细胞同时通过分泌IL-10和TGF-β等发挥免疫抑制作用。只有调节性T细胞与效应细胞处于相对平衡状态,才能维持机体正常免疫功能。大量研究显示[8，9]，Treg细胞可以抑制自身免疫病的发生，当Treg细胞减少时可使患者免疫抑制功能减弱,而体液免疫功能增强使B细胞活化产生一定数量的自身抗体,容易造成自身损害而发生自身免疫性疾病,同时易造成致病因子的扩散或长期持续存在而引起疾病复发。

由于CD25能表达于部分效应性T细胞表面，无法特异性标记Treg[10]。因此，本研究选用核转录因子Foxp3作为Treg细胞的标记，能更真实地反映患者体内有功能的Treg细胞群。有关Treg细胞的研究已涉及多个学科领域，但目前国内外鲜少有Treg细胞在精神分裂症中的研究，本研究结果显示，在排除躯体疾病及药物的影响后，精神分裂症急性期患者体内CD4+Foxp3+Treg细胞比例低于缓解期，表明精神分裂症急性期患者可能由于体内CD4+Foxp3+Treg细胞减少，对机体自身免疫反应的抑制功能减弱，促使B淋巴细胞产生一定数量的自身抗体，从而导致自身免疫性损伤。此外，大部分精神分裂症患者往往具有病史较长，病情反复的特点，可能与CD4+Foxp3+T细胞减少，抗体无法清除、致病因子扩散或长期持续存在有关。但本研究结果显示，精神分裂症患者病情严重程度及病程与CD4+Foxp3+T细胞比例并无相关性，可能与本研究所选对象为首发病例及样本量偏小有关。

Foxp3+作为Treg细胞发育和成熟的调控因子，对其发挥抑制功能至关重要，被认为是Treg细胞的特异性标志[11]。研究发现，Foxp3基因突变或敲除的小鼠，体内CD4+CD25+Treg细胞数量下降，调节功能缺陷，可诱发严重的自身免疫反应[12]。因此，Foxp3也被认为可能是Treg启动免疫抑制功能的“开关”，故直接检测Foxp3表达水平更能反映体内Treg的功能状态。本研究检测了单个细胞核的Foxp3 mRNA水平的表达，结果显示急性期Foxp3+表达低于缓解期，经治疗后其表达水平升高，结论与测定外周血CD4+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例的结果相一致，因此考虑在精神分裂症急性期，表达Foxp3的Treg数量变化，可能在一定程度上打破了机体的免疫平衡,导致免疫功能紊乱，从而增加了精神分裂症的易感性。

Treg细胞能够分泌TGF-β和IL-10，这些细胞因子具有抑制抗原递呈细胞及拮抗效应性T细胞的功能,在多种自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。而TGF-β和IL-10可能进一步诱导Treg 细胞分化，使机体免疫功能低下或受到抑制。

TGF-β是维持 Treg 细胞数量及功能的重要因子[13]，TGF-β的生物学功能主要表现在保护神经元、调节炎症反应、组织修复、胚胎发育等，但还可通过抑制免疫效应细胞的增殖、分化以及抑制细胞因子的产生，这些作用均通过细胞内的信号通路参与Treg细胞及Th17细胞等的表达而实现[14]。有研究表明，TGF-β家族成员能够通过剂量依赖的方式，在体内外促进 Treg 细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞反馈调节作用[15]。当TGF-β浓度降低时，这些免疫抑制功能必然会受到影响，从而加剧精神分裂症患者的免疫失衡状态。国内有报道精神分裂症患者血清TGF-β水平高于对照组[16]，本研究中显示急性期TGF-β mRNA表达量低于缓解期，但经数据分析后显示此差异不具有统计学意义。

IL-10被认为是抗炎细胞因子，又称细胞素合成抑制因子。具有抑制自身抗体合成的作用和抑制多种炎性分子的产生和生物活性的作用。因此，它是细胞因子和免疫细胞稳态的基础[17]。多个研究小组的证据显示[18，19]，Treg细胞能够诱导巨噬细胞产生高水平的IL-10并协同抗原提呈细胞的免疫抑制。Treg细胞水平的下降能降低IL-10的分泌,并加速Th1细胞的活化。IL-10 水平的下降，会致使体内自身抗体以及多种炎性因子的合成有所增加且长期持续存在，从而增加疾病的易感性。国内外有关精神分裂症患者血清中IL-10水平研究的结果并不一致，有报道提示精神分裂症患者IL-10高表达[20，21]，也有报道提示IL-10低表达[22]。也有与本研究结果相近的报道[23]。本研究结果提示,急性期IL-10 mRNA表达量低于缓解期，但经数据分析后显示此差异不具有统计学意义。此结果可能与本研究试验方法不同及样本量偏小有关。

IL-6属于促炎性因子，具有促进急性相蛋白和免疫球蛋白合成、生成前列腺以及 β 细胞增殖的作用。主要由免疫细胞的单核/巨噬细胞释放，其水平可反映精神分裂症患者的非特异性细胞免疫状态[24]。IL-6参与的自身免疫作用于中枢神经细胞, 可提高额叶、海马等脑区多巴胺及5-羟色胺活性，从而导致大脑功能的紊乱。本研究结果显示精神分裂症患者急性期IL-6 mRNA表达水平高于缓解期，与国外大多数相关研究结果一致[25，26]，提示炎症反应在精神分裂症的病程进展中具有重要作用。

综上所述，免疫反应和炎症反应在精神分裂症的发展过程中发挥了重要作用，日益受到重视。调节性T细胞可能通过影响多种细胞因子的分泌及其他机制参与到精神分裂症的发病过程。本研究为在该领域的初期探索，有许多不足之处，今后拟在此基础上进一步开展深入研究，以期能为精神分裂症的诊疗提供新的思路。