芝麻棒孢根腐病原菌生物学特性研究

孙会杰，高德学，程洪森，那艳斌，孙敏杰，张晓波

（辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳 111000）

芝麻（Sesamum indicum L.）是世界上重要的油料作物之一[1]，世界上大约有76 个国家有规模种植芝麻，但产量以亚洲和非洲等国家为主。印度、苏丹、缅甸、中国是芝麻的主要生产国。芝麻籽富含脂肪、蛋白质、维生素和矿物质[2]。芝麻油不仅是人们食用油的重要来源，也是色漆、清漆、肥皂、香水、杀虫剂和药物等生产的工业原料[3]。同时也是一种药食同源的特色油料作物，蛋白质含量高达25%，富含黄酮类和多酚类物质，具有抗氧化、增强免疫力等多种生理活性[4-5]。芝麻病害是严重影响芝麻产量的重要因素[6]，芝麻病害不仅降低籽粒产量，而且病菌产生毒素影响人畜健康[7]。近年来，由多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）侵染芝麻的根部，导致苗期或成株期死亡的芝麻病害在我国首次发现[8]。据调查目前该病在辽宁、吉林和内蒙等省区芝麻上均有不同程度发病，重病地块发病率高达100%，个别地块甚至因病造成绝收。由于该病是我国芝麻新病害，国内外关于此病的研究报道缺乏，该病害发生原因不清，缺乏有效的控制病害措施，使之危害加重，已成为芝麻生产中亟待解决的问题。诸多研究表明，病原菌生物学特性和病害症状认知是对于新病害深入研究不可缺少的基础资料，为此，本研究针对芝麻生产上新见病害问题，对其病害症状及病原菌的生物学特性进行系统观察和研究，旨在为该病流行学、抗病品种选育与有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2017～2018 年，在辽宁省经济作物研究所芝麻试验地采集芝麻发病植株的发病组织，并分离保存病原菌。芝麻品种为辽芝8 号。

供试 PDA 培养基为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL，pH 值自然。查彼培养基（Czapek）为：蔗糖 30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15g，蒸馏水1000mL，pH 值 7.0 ～7.2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离及病害症状描述 采集辽宁省经济作物研究所芝麻试验地的芝麻病株，将病根切成3～4cm小段，用2%次氯酸钠（NaClO）液体表面消毒2min，无菌水漂洗3 次，置于水琼脂培养基（WA）上，25°C 培养5d，待病菌分生孢子产生后，在高倍体视镜下从PDA 培养基上用接种针挑取单孢，获得纯化菌株备用。通过人工土壤接菌法发病症状观察和田间病害症状调查对该病害症状进行系统描述。

1.2.2 不同培养基对病菌生长的影响 考察V8 培养基、酪蛋白-乳糖水解液培养基（ATCC）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦琼脂培养基（OA）、麦芽提取物琼脂培养基（MEA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、芝麻种子煎汁琼脂培养基（ZMZA），芝麻茎杆煎汁琼脂培养基（ZMGA）、平板计数琼脂培养基（PCA）和水琼脂培养基（WA）等12 种培养基对病菌生长的影响。将纯化培养的芝麻棒孢根腐病菌菌落，用打孔器，从菌落边缘打孔打取直径5mm 菌饼，在无菌操作下分别移入不同种类培养基平板中心，每皿1 片，每处理重复4 次，置入28℃恒温培养箱中培养10d，采用十字交叉法测量菌落直径，并对菌落形状进行记载和描述。

1.2.3 不同温度对菌丝生长的影响 病菌活化培养后，用打孔器从菌落边缘打取直径5mm 移植到PDA 培养基平板中心，每皿 1 片，设 10 种处理，分别置于 5，8，10，15，20，25，28，30，35，40℃下培养，每个处理重复 4 次。培养10d 后采用十字交叉法测量菌落直径，观察其培养性状及形态结构特征。

1.2.4 不同 pH 值对菌丝生长的影响 用 1mol·L-1NaOH 和 1mol·L-1HCl 调节 PDA 的 pH 值，将纯化培养的菌落，用打孔器从菌落边缘打取直径 5mm 的病菌片移置于不同 pH 值（3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5，11.5，12.5）的PDA 平板中央，于28℃恒温培养，每个处理重复4 次，采用十字交叉法分别在培养7d 和10d 测量菌落直径，并观察菌落形状及颜色。

1.2.5 不同碳源对菌丝生长的影响 以查彼培养基为基础培养基，硝酸钠(NaNO3)为固定氮源，病原菌活化培养后，移植直径5mm 的病原菌片到不同碳源（葡萄糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉、山梨醇）的培养基上，置于28℃恒温培养，分别在培养7d 和10d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理4 次重复，并观察菌落形状及颜色。

1.2.6 不同氮源对菌丝生长的影响 以查彼培养基为基础培养基，固定碳源为蔗糖，将直径5mm 菌片移到不同氮源（硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、蛋白胨、牛肉浸膏、苯丙氨酸、尿素、草酸铵、乙酸铵）的平板培养基上，于28℃恒温培养。分别在培养7d 和10d 后采用十字交叉法测量菌落直径，考察不同氮源对菌丝生长的影响，每处理4次重复，并观察菌落形状及颜色。

1.2.7 不同光照对菌丝生长的影响 病原菌活化培养后，从菌落边缘打取直径5mm 的病菌菌片到PDA 培养基上，考察全光照处理（300lx）、全黑暗培养（0lx）和光暗交替(300lx 12h/0lx 12h)处理对菌丝生长的影响，每个处理重复4 次，置于28℃恒温培养，分别在培养7d 和10d 后采用十字交叉法测量菌落直径，观察菌落形状及颜色。

2 结果与分析

2.1 病害症状

通过在芝麻生产田自然发生的病株和人工接种条件下病株症状表现，发现该病的典型症状为植株萎蔫，叶片自下而上黄化和盛花后期落叶，逐渐干枯，死亡。根系发育不良，根毛明显减少，根部红棕色或红褐色病斑（图1）。随着发病进展,根逐渐变成紫褐色,表皮脱落,局部或全部腐烂。病株早衰，蒴果不能正常成熟，严重影响了芝麻种子和芝麻叶片的产量和品质。幼苗期病害症状为植株发育迟缓，叶片失绿，植株萎蔫、枯死，根部腐烂呈紫红色。

图1 芝麻棒孢菌根腐病症状Figure 1 The symptoms of sesame root rot caused by C.cassiicola

2.2 不同培养基对菌丝生长的影响

由表1 可知，不同培养基对芝麻根腐病菌的生长量和菌落形状有显著影响，在V8、CMA、ATCC、PSA、OA、PDA 等 6 种培养基上生长最快，菌落直径最大，分别为 77.75，77.22，76.51，76.31，74.01，73.67mm，菌丝短、致密，是病菌培养良好培养基。在MEA 培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上生长较慢，在WA 培养基上生长最慢。

2.3 不同温度对菌丝生长的影响

由图2 可知，不同温度对芝麻棒孢菌的菌落直径有显著影响，病菌的适宜生长温度范围为25～30℃，最适生长温度为28℃，低于5℃，高于40℃该病菌停止生长。可见，该病菌是高温类型菌，这也可能是每年7～8 月高温多雨季节病害加重流行的原因。

2.4 不同pH 值对菌丝生长的影响

由图3 可知，芝麻棒孢菌的最适pH 值为6.5，培养7d 和10d 时菌落直径最大，分别为40.65mm 和58.00mm，当pH 值大于8.5，小于5.5 时病原菌生长较慢，当pH 值小于3.5 或大于12.5 时，病原菌菌丝死亡，不再生长。

2.5 不同碳源对菌丝生长的影响

由图4 可知，不同碳源对棒孢菌的生长量和菌落形状有影响，培养7d 时以葡萄糖、木糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇、果糖为碳源的病原菌生长较快，在蔗糖、山梨醇、可溶性淀粉上生长较慢。菌落生长10d 时以木糖为碳源的棒孢菌生长最快，菌落直径为79.50mm，以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露醇、果糖为碳源的棒孢菌生长较慢，以山梨醇、可溶性淀粉为碳源的培养基上生长最慢。

2.6 不同氮源对菌丝生长的影响

由图5 可知，培养7d 时以蛋白胨为氮源的病原菌生长最快，菌落直径为72.50mm，培养10d 时以蛋白胨、牛肉浸膏为氮源的病原菌生长最快，菌落直径为85mm，两者差异不显著，以硝酸钾、硝酸钠、苯丙氨酸、乙酸铵为氮源时病原菌生长较快，以硫酸铵为氮源时生长最慢。

表1 不同培养基对棒孢菌的影响（10d）Table 1 Effect of culture medium on mycelial growth of C.cassiicola（10d）

图2 温度对菌落直径的影响Figure 2 Colony diameter of pathogen cultured at different temperature

图3 pH 对菌落直径的影响Figure 3 Colony diameter of pathogen cultured at different pH value

2.7 不同光照对菌丝生长的影响

由表2 可知，病原菌菌丝生长对光照要求存在差异，3 种处理病菌均能正常生长，菌落形态均为圆形，边缘整齐，棉絮状，连续光照培养菌丝生长较快，光暗交替(12h/12h)、24h 黑暗培养菌丝生长较慢，连续光照培养的棒孢菌日生长量较大，与其他两种处理差异显著，3 种处理菌落颜色有所不同，黑暗培养菌为深灰色，而光暗交替和连续光照的菌落颜色稍深，为橄榄绿色。

3 讨论与结论

图4 不同碳源对菌落直径的影响Figure 4 Colony diameter of pathogen cultured at different carbohydrate source

图5 不同氮源对菌落直径的影响Figure 5 Colony diameter of pathogen cultured at different nitrogen source

表2 不同光照对棒孢菌生长的影响Table 2 Effect of light treatment on mycelial growth of C.cassiicola

针对我国芝麻上发生一种严重影响产量新病害--棒孢菌根腐病问题，从病害症状及病原菌生物学特性等方面进行研究。通过田间自然发病症状和人工接种症状观察，明确芝麻棒孢菌根腐病典型的发病症状为植株萎蔫，叶片自下而上黄化和盛花后期落叶，逐渐干枯，死亡。病株根系发育不良，红棕色，须根明显减少，表皮粗糙,局部腐烂，导致芝麻早衰，蒴果不能正常成熟。幼苗表现发育迟缓，叶片失绿，部分病株枯死，根部腐烂呈红或紫红色。该病害症状与尖孢镰孢菌引起的枯萎病症状有相似之处，均为植株枯萎和根部腐烂[10]，其不同之处在于芝麻棒孢菌根腐病根呈紫红色、腐烂。

对芝麻棒孢根腐病菌生物学特性研究表明，芝麻棒孢菌的生长受培养基、温度、氮源、碳源、pH 等因素的影响：芝麻棒孢菌在V8 培养基、酪蛋白-乳糖水解液培养基（ATCC）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、蔗糖琼脂培养基（PSA）、燕麦琼脂培养基（OA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）6 种培养基上生长最快；病菌的最适生长温度为28℃，低于5℃，高于40℃病菌不能生长；对碳源利用较为广泛，以蛋白胨、牛肉浸膏为氮源的病原菌生长最快；在PDA 培养基上培养芝麻棒孢菌的最适pH 为6.5；不同光照时间对棒孢菌的日生长量略有影响，连续光照培养菌丝生长较快、菌落颜色较深为橄榄绿色。秦人全等[10-11]报道引起木棉褐斑病及巴西橡胶树棒孢霉落叶病的多主棒孢菌的最适生长条件为pH 值6、28℃，与本研究结果基本相似。从本试验结果看，该病害是一种高温高湿型病害, 最适温度28℃, 与田间病情调查结果吻合，在辽宁，7～8 月高温且逢多雨时节病害流行加重的规律一致。

橡胶多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明显的寄主专化性现象[12-13]，多主棒孢菌的致病力同其寄主来源存在显著的相关性，不同菌株致病性及其生物学特性等方面存在一定差异[14]，而且诸多研究发现多主棒孢病菌致病性易发生变异，寄主范围广泛[15-16]，而有关芝麻棒孢菌对其他寄主的致病力有待于进一步的研究。本研究通过对芝麻棒孢菌生物学特性的研究，阐明病菌生长和环境条件的关系，为解释芝麻棒孢菌根腐病的发生、发展规律提供了重要依据，也为人工接种鉴定芝麻品种的抗病性明确了病菌生长、产孢最适条件；同时也为该病害的最佳防治药剂选择提供一定的理论基础。

近年对多主棒孢引起的病害报道较为广泛，多主棒孢可以引起橡胶棒孢叶斑病、黄瓜棒孢叶斑病、甜瓜棒孢叶斑病、莲藕棒孢霉叶斑病、草莓棒孢叶斑病等多种作物的叶斑病，主要侵染寄主的叶片、茎杆等部位[17-21]。植物病原真菌寄主选择性毒素对寄主植物具有特异性生理活性和专化性作用位点，可以对寄主的生理生化代谢酶系统活性及核酸代谢等产生显著的影响，可诱发寄主产生典型的病害症状[22-24]，报道由棒孢菌侵染寄主叶部或茎部的发病的较多，该菌侵染寄主根部的病害报道极少，仅SATO 等[25-26]报道了棒孢菌可以侵染大豆的根部，引起大豆根腐病。本试验首次发现了芝麻棒孢菌可以侵染芝麻根部，打破了棒孢菌只侵染寄主叶部和茎部的传统认知，明确了该病菌侵染根部的发病症状，为生产上的病害识别和防治提供了科学依据。