利用SRAP标记构建山东省苹果资源指纹图谱

李慧峰，冉 昆，王 涛

（山东省果树研究所，山东 泰安271000）

山东苹果属植物资源丰富，除少数野生种外，大部分为栽培种，种间杂种较多，类型多样，变异幅度大[1]，种质资源鉴定工作难度较大。目前苹果属植物的分类鉴定主要基于传统的形态学方法，此方法对鉴定人员素质要求较高，需要有丰富的植物学知识及严格的实践训练[2]，所以限制了苹果属植物资源分类工作的开展。随着分子技术发展，在DNA 水平上建立高效、准确的鉴定方法已成为可能，其中分子标记技术便是重要手段之一。

SRAP(sequence related amplified polymorphism) 标记以独特的双引物设计扩增基因的开放式阅读框特定区域，是基于不同个体DNA 序列的启动子、内含子、间隔区长度的差异而表现出多样性的显性分子标记，相对于其他分子标记更容易得到选择序列条带，已被广泛应用于新疆石榴[3]、山楂[4]、梨[5]、新疆野苹果[6]、柑橘[7]、枇杷[8]、桃[9]等果树种质资源的遗传多样性、群体遗传结构、亲缘关系、指纹图谱等方面研究，并取得良好的效果。关于苹果属植物遗传多样性研究多基于SSR 标记技术[10-11]，鲜见利用SRAP 标记在构建地方苹果属植物指纹图谱的报道。针对山东的地方苹果属植物资源分类研究相对滞后的现状，本研究选取59 份地方苹果资源，利用SRAP 技术进行遗传多样性分析，构建指纹图谱，旨在为山东省苹果属植物资源鉴定及数据平台开发提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

2018～2019 年试验在国家苹果工程技术中心进行。供试的59 份资源取自于山东省果树研究所苹果资源圃（表1）。每份资源取幼嫩叶3～4 片，混合后用锡箔纸包好，置于冰盒带回实验室，液氮冷冻后于-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 供试材料基因组DNA 提取 采用改良CTAB 法[12]提取基因组DNA，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。用紫外吸收法检测DNA 浓度并稀释成50 ng·μL-1，贮存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 SRAP-PCR 采用LI 等[13]发表的引物，由青岛派森诺基因生物技术有限公司合成（表2）。正向引物15条，反向引物16 条，组合得到240 对引物。随机选用5 号、9 号、55 号3 份样品进行引物筛选，共选出扩增条带清晰、丰富、稳定的25 对引物组合用于后续试验。PCR 体系和扩增产物的纯化体系参照李秀等[14]建立的体系，略有改动。取扩增产物10μL 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时以2000 bp DNA Ladder Marker 作为分子量标记，100V 恒压电泳40～60 min，通过紫外凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 数据统计分析

对电泳胶图进行人工读带，对扩增条带按有（1）或无（0）进行统计，建立二元数据矩阵。统计多态性条带数、总条带数和多态性条带比率P（Percentage of polymorphic sites）。利用Botstein 公式计算多态性信息含量（PIC）；利用 POPGENE version 1.32 软件计算观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s 遗传多样性指数（H）和Shannon 信息指数（I），运用NTSYS pc version 2.10e 软件进行聚类分析（UPGMA 法）和构建聚类图，计算遗传距离（GD）及遗传相似系数（GS）。从25 对引物组合扩增的图谱中筛选出多态性好、清晰、鉴别效率高的图谱，构建59 份苹果种质资源数字指纹图谱，根据指纹图谱出现的概率公式P＝1/2n，计算图谱的置信概率。

表1 供试的59 份苹果资源Table 1 Material of 59 Malus germplasm

表2 SRAP 引物序列Table 2 The sequence information of SRAP primers

2 结果与分析

2.1 遗传多样性

PIC 值是衡量引物合适程度的重要指标，可以反映引物揭示信息量的多少，PIC 值越高代表包含的信息量越大，当PIC＞0.5 时，引物为高度多态性信息引物[2]。在组合的240 对引物中，有25 对能扩增出较多特异性条带且条带清晰，同时检测到的 PIC 值为0.5201～0.9510，表明这 25对引物均为高度多态性信息引物，可以用于苹果资源遗传多样性研究。图1 为引物Me10～Em4对59 份供试材料的SRAP-PCR 扩增图谱。

利用25 对引物对59 份苹果资源进行SRAP扩增，共扩增出176 条清晰条带，DNA 片段长度在 100～2 000 bp；不同引物的扩增带数从 4～10 条不等，引物Me5-Em3 扩增的条带最多，为10 条，平均每对引物获得DNA 谱带7.04 条；在176 条扩增带中，多态性条带158 条，多态性比率为89.77%（表3），表明供试资源具有较高的遗传多样性。

2.2 聚类分析

59 份样品间存在不同程度的遗传差异，呈现出较为丰富的遗传多样性。聚类结果显示，样品间的相似性系数为0.6540～0.9829，平均为0.7060。当遗传相似系数为0.7010 时，59 份供试苹果材料可以分为3 大类群（图3）：第Ⅰ类群仅包括1 份资源，其为产于泰山极顶的泰山海棠，说明泰山海棠与其他资源的亲缘关系较远；第Ⅱ类群包括 29 份资源，在相似系数为 0.7480 处，可以进一步划分为 IIa、IIb、IIc、IId 和 IIe 共 5 个亚类，以海棠、楸子等类型为主，包括少量的花红（M.asiatica）类型；第Ⅲ类群也包括29 份资源，在相似系数为0.7480 处，可将其分为Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd、Ⅲe、Ⅲf、Ⅲg 和Ⅲh 共 8 个亚类。Ⅲa 亚类包括 5 份苹果资源和 1 份大果型花红（M.asiatica）资源，其中1 号资源与30 号资源亲缘关系最近，因二者为芽变关系。Ⅲb 亚类包括3 份花红资源和1 份大果型海棠。其余亚类群主要是花红资源、海棠和楸子资源。聚类结果显示，位于Ⅲc 亚类的中国绵苹果3 号资源花彩和4 号资源红彩聚在一起，表明二者亲缘关系很近。

图1 引物Me10-Em4 对59 份材料的电泳图谱Figure 1 The electrophoretogram of 59 samples amplified by primer Me10-Em4

表3 SRAP 引物组合和扩增结果Table 3 Results and polymorphism of SRAP primer combinations

图3 基于SRAP 标记的59 份苹果材料的UPGMA 聚类图Figure 3 UPGMA dendrogram of 59 samples based on SRAP marker

2.3 指纹图谱

从25 对引物组合扩增的谱带中，筛选出了多态性好、稳定性高的48 条谱带，使之数字化，构建的59 份山东地方苹果属植物指纹图谱（图4）。根据P=1/2n可知，带型全部相同的概率为3.55×10-25，置信概率达99.99%。

图4 SRAP 标记构建的59 份苹果资源指纹图谱Figure 4 Molecular finger printing of 59 Malus germplasms set up by SRAP marker

3 讨论与结论

SRAP 标记具有简便、高现共显性、易得到分离条带、高产率等优点，在遗传育种学领域已有广泛的应用[15]，是一个评价遗传多样性、品种鉴定和系统发育的有效工具[16]。另外，SRAP 标记与RAPD 标记相比，其引物数量虽少，但由于SRAP 标记正、反向引物具有通用性，所以引物的利用率非常高；与AFLP 相比，没有酶切、连接与扩增杂交等繁杂步骤；与其他一些分子标记技术相比，SRAP 标记引物设计较容易、操作方便[17]。因此，SRAP 分子标记优势更突出。本试验结果显示25 对多态性引物共扩增出DNA 条带176 条，其中多态性条带158 条，在PPB 方面，有9 对引物组合基因组扩增条带的多样性达到了100%，多态性比率为89.77%，说明SRAP 标记在苹果属植物基因组中具有丰富的多态性。Ne、H、I 作为SRAP 引物多态性评价的重要参数，在本研究中表现良好，其平均值分别达到了1.49、0.28 和0.43。作为评价分子标记多态性的重要指标，本研究中的PIC 均值为0.88，远大于0.5，说明本研究筛选所得的引物组合为高度多态性信息引物，综合评价认为SRAP 标记在苹果属植物种质中具有较高的鉴别能力，更能提供种质差异的遗传信息。

根据UPGMA 聚类分析结果，选取遗传相似系数0.7010 进行分类，59 份供试苹果材料可以分为3 大类群。第Ⅰ类群为原产山东的野生资源泰山海棠，第Ⅱ大类群以海棠和楸子为主，含有少量的小果型花红，第Ⅲ大类群主要以苹果、花红为主，含有少量的海棠和楸子。当遗传相似系数为0.7480 时，第Ⅱ大类群、第Ⅲ大类群又分别可以划分出若干小的类群，苹果（M.domestica）聚在一起，中国绵苹果（M.domestica subsp.chinesis）、大部分的花红（M.asiatica）聚在一起，大部分的海棠（M.micromalus）与楸子（M.prunifolia）交互聚在一起，聚类结果总体上与李育农[18]苹果属植物分类标准相一致。少量的花红（M.asiatica）以及海棠（M.micromalus）、楸子（M.prunifolia）没有完全区分开来，可能主要因为这些栽培种均形成于种间杂交，遗传背景较为复杂所致。

本研究中采用了25 对引物组合的方式来鉴定供试样品，有效的克服了单一引物扩增出的特征条带少、鉴别效率低的问题，有效的将所有样品进行了区分。建立的指纹图谱，置信率达99.99%，进一步表明利用SRAP标记在鉴别亲缘关系复杂苹果属植物资源过程中具有高效性。种质资源是果树品种选育重要基因源。但是，我国苹果育种领域普遍存在育种目标单一、核心亲本被反复使用、育种材料间的亲缘关系较近、遗传背景狭窄等严重问题，导致我国一直缺乏具有国际市场竞争力的品种。面对现代育种的新形势，采用地理远缘、亲缘关系远缘的亲本进行杂交已经成为业界共识，因此全力保护地方资源、充分挖掘地方资源的遗传潜力，将会是一项十分重要的基础工作。但是，由于种种原因，山东地方资源正在遭受严重破坏，资源损失严重，据资料显示[19]，仅2011～2014 年山东沂水崔家峪苹果资源就由12 份减少到2 份，其他地区情况也不容乐观。因此，采用现代技术尽快建立苹果资源有效鉴定技术体系，为保护地方资源提供技术支撑，已刻不容缓。