美拉德反应产物的制备及在混合油脂微胶囊中的应用

陈正军,张文斌1,,*,杨瑞金1,,华 霄1,,赵 伟

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;3.江南大学江苏省食品安全与质量控制协同创新中心,江苏无锡 214122)

随着人们消费水平提升与对健康的日益重视,单一油脂的摄入已不能满足消费者对营养的需求,目前代餐产品中已经设计了包括中链甘油三酯(Medium Chain Triglyceride,MCT)、椰子油、亚麻籽油和红花籽油在内的混合油脂,该产品主要面向一些对长链脂肪酸吸收不良的人群,具有易吸收、营养密度高、升糖指数低的特点。MCT和椰子油含有丰富的中链脂肪酸,中链脂肪酸酯能满足脂肪吸收消化不良的患者对脂肪的需求,从而为人体提供高热量来源和乙酰基来源[1]。另外,α-亚麻酸是人体必需脂肪酸,在亚麻籽油中含量高达53%[2],红花籽油中亚油酸含量在73%～85%,是一种保健食用油[3],四种油脂按照一定比例调和,能极大地发挥营养保健优势,可作为代餐食品的重要配料。但是亚麻酸和亚油酸是一种不饱和脂肪酸,易受外界环境影响,在贮藏和加工过程极容易被氧化,使得营养保健和生理活性功能减弱,应用受到极大限制[4]。椰子油的熔点在24～29 ℃,当温度在22 ℃以下时变为白色固态油脂,不利于工业加工生产[5]。目前针对这些问题主要通过微胶囊技术,微胶囊能够形成良好的功能性屏障,有助于芯材成分理化稳定性提高,同时有利于其加工应用[6]。

近年来油脂微胶囊中大多采用混合壁材,虽然能够解决低载量条件下包埋率低的问题,但是微胶囊的储藏稳定性不佳、粉体流动性能差等问题依然存在。刘斯博等[7]以大豆蛋白和亚麻籽胶的混合壁材包埋亚麻籽油,载油量40%条件下包埋率为86%,60 ℃条件下,2 d后微胶囊化的亚麻籽油过氧化值为6.57 mmol/kg,超过一级亚麻籽油限值。李彩云等[8]利用喷雾干燥法制备红花籽油微胶囊,研究了鲜蛋清分别与阿拉伯胶、β-环糊精、麦芽糊精复配后的壁材组合对微胶囊包埋率的影响,研究发现在载油量20%条件下,鲜蛋清与麦芽糊精的壁材组合包埋率最佳,达到96.51%,但是油脂微胶囊表面结构皱缩明显。国内外关于油脂微胶囊载量一般在10%～40%[7,9-10],随着油脂载量的提高,包埋率降低以及抗氧化性差等问题逐渐凸显。此外,油脂微胶囊在代餐产品中应用时往往出现流动性不佳等问题。为解决这些问题,研究一种新型壁材,以满足现有工业对于高载量油脂微胶囊的需求是至关重要的。

本研究以酪蛋白酸钠(Sodium caseinate,SC)和低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide,IMO)的美拉德反应产物(Maillard reaction products,MRPs)为壁材包埋混合油脂,采用喷雾干燥技术制备微胶囊。SC与IMO发生交联,能够提高其成膜的机械强度及阻隔性能,同时MRPs有一定的抗氧化性能[11-12],因此,本研究通过制备MRPs并将其应用于混合油脂的包埋,改善微胶囊理化性能,以期为高载量油脂微胶囊的生产及应用提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低聚异麦芽糖 山东百龙创园生物科技有限公司;酪蛋白酸钠 恒天然有限公司;MCT 苏州佳之源健康科技有限公司;椰子油 益海(连云港)粮油工业有限公司;亚麻籽油 红井源油脂有限公司;红花籽油 中粮塔原红花(新疆)有限公司;单硬脂酸甘油酯(单甘脂) 丰益乳化材料科技(上海)有限公司;蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯) 柳州爱格富食品科技股份有限公司;菲啰嗪 Sigma公司,其他化学试剂均购于国药化学试剂有限公司。

T25高速剪切分散机 德国IKA集团;高压均质机AH-2010 ATS工业系统有限公司;水浴锅 上海恒科学仪器有限公司;尼鲁喷雾干燥器 基伊埃工程技术(中国)有限公司;Su1510扫描电子显微镜 日本东京日立高科技公司;FA-ST水分活度仪 法国GBX。

1.2 实验方法

1.2.1 酪蛋白酸钠与低聚异麦芽糖制备美拉德反应产物

1.2.1.1 美拉德反应产物的制备 配制一定浓度的SC溶液,然后按SC与IMO的质量比添加IMO,底物完全溶解后,利用夹层反应器加热到一定温度,调节pH,反应一定时间,制备得到MRPs。以接枝度和褐变程度为指标,采用单因素实验分别研究了反应时间、温度、pH、SC与IMO的添加比例以及SC浓度对反应的影响。

1.2.1.2 反应时间对美拉德反应程度的影响 控制SC浓度6%,SC与IMO质量比为1∶2,调节pH7.0,80 ℃,进行糖基化接枝反应,考察反应时间(30～240 min)对MRPs接枝度和褐变程度的影响。

1.2.1.3 反应温度对美拉德反应程度的影响 控制SC浓度6%,SC与IMO质量比为1∶2,调节pH7.0,反应120 min,研究了不同反应温度(50～90 ℃)对MRPs接枝度和褐变程度的影响。

1.2.1.4 反应pH对美拉德反应程度的影响 控制SC浓度6%,SC与IMO质量比为1∶2,80 ℃反应120 min,研究了不同pH(6～9)对MRPs接枝度和褐变程度的影响。

1.2.1.5 底物比例对美拉德反应程度的影响 控制SC浓度6%,调节pH8.0,80 ℃反应120 min,研究了不同SC与IMO质量比(1∶0.3、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)对MRPs接枝度和褐变程度的影响。

1.2.1.6 酪蛋白酸浓度对美拉德反应程度的影响 控制SC与IMO质量比为1∶3,调节pH8.0,80 ℃反应120 min,研究了不同SC浓度(3%～8%)对MRPs接枝度和褐变程度的影响。

1.2.1.7 接枝度的测定 游离氨基含量采用OPA法进行测定[13]。以赖氨酸代替样品做标准曲线,从而计算样品中自由氨基的含量A。

式(1)

式中:At:接枝物的自由氨基含量,mol/L;A0:单一蛋白在相同条件下的自由氨基含量,mol/L。

1.2.1.8 美拉德反应褐变程度的测定 取反应后冰浴至25 ℃的样品,在4000 r/min的条件下离心10 min之后,用0.1%(w/w)SDS稀释样品上清20倍,同时用稀释液作空白对照,以420 nm吸光值A420 nm表示褐变程度(BI)[14]。

1.2.2 美拉德反应产物的抗氧化性

1.2.2.1 还原力的测定 还原力测定参照文献[15],取1.0 mL MRPs与1.0 mL磷酸盐缓冲液和1.0 mL、1.0%(w/v)的K3Fe(CN)6溶液混合均匀,于50 ℃反应20 min后立即冰浴至25 ℃,加入1.0 mL(10% w/v)三氯乙酸溶液,混合后以4000 r/min离心10 min。取上清液1.0 mL与1.0 mL蒸馏水和200 μL、0.1%(w/v)的FeCl3,混合均匀,静置10 min后测定700 nm处的吸光度A700,吸光度代表还原能力,空白以蒸馏水代替K3Fe(CN)6。

1.2.2.2 美拉德反应产物Fe2+螯合能力测定 样品螯合Fe2+的能力测定参见文献[15],准确取1 mL样品溶液,加入1.85 mL去离子水和0.05 mL、2 mmol/L FeCl2混合,室温25 ℃条件下放置30 s,加入0.1 mL、5 mM菲啰嗪试剂,混合均匀室温下放置10 min,4000 r/min离心30 min,测定562 nm处吸光值,以等体积的蒸馏水代替样品做空白对照。螯合能力的计算公式:

式(2)

1.2.3 乳化剂对混合油脂微胶囊包埋率的影响 以MRPs为壁材,分别研究了单甘酯(3%),蔗糖酯(3%)以及单甘酯(2%)与蔗糖酯(1%)复配使用对混合油脂微胶囊表面油及包埋率的影响。

1.2.4 混合油脂微胶囊的制备 利用1.2.1中制备的MRPs,在60 ℃条件下添加68%(w/w)混合油(MCT∶椰汁油∶红花籽油∶亚麻籽油为2.8∶1.0∶1.0∶0.4),壁材与芯材质量比为1.0∶2.4,添加2%单甘酯与1%蔗糖酯作为乳化剂,12000 r/min高速剪切5 min,然后以40 MPa与18 MPa均质压力制备出混合油乳状液,经喷雾干燥法制得混合油脂微胶囊。喷雾干燥条件为:进风温度180 ℃,出风温度80 ℃,雾化空气进气速度3 m3/h,进料速度20 mL/min。

1.2.5 混合油脂微胶囊的包埋率测定 表面油[16]:精确称取m0混合油微胶囊样品于干燥的锥形瓶中,将60 mL石油醚分三次加入洗涤,每次均搅拌30 s,静置60 s后过滤至烘干的平底烧瓶m1。在50 ℃水浴中用旋转蒸发仪蒸干溶剂,60 ℃烘干至恒重,称重m2。每一样品进行3次平行试验。微胶囊表面油(So)的计算公式为:

式(3)

总油[17]:将精确称量的1 g微胶囊加入到5 mL温水(50 ℃)中并振荡15 min。将所得溶液用90 mL正己烷/异丙醇(3∶1 v/v)萃取两次,并在4000 r/min下离心15 min。将澄清的有机相收集并蒸发,在45 ℃下直至提取的脂肪残余物达到恒重。计算得到总油(To),从而计算包埋率(EE)。

式(4)

1.2.6 混合油脂微胶囊理化性质的研究

1.2.6.1 混合油脂微胶囊的含水量与水分活度 根据微胶囊在热风干燥箱(2 h,105 ℃)干燥后的失重情况,计算混合油微胶囊(2 g)的水分含量。

式(5)

式中:m0:干燥前称取微胶囊质量,g;m1:干燥2 h后微胶囊质量,g。

水分活度(Aw)由水分活度计在25 ℃下测量。

1.2.6.2 微胶囊密度及流动性的测定 参考文献方法[18],准确称取M0混合油微胶囊样品,装入有刻度的量筒中,缓慢晃动使微胶囊粉末自然下沉,测定体积V0,并计算微胶囊的堆积密度(ρb)。每一样品进行3次平行试验。

在堆积密度的基础上,用一定的力度拍击量筒之后记录体积(Vt),计算微胶囊粉密度(ρt)。

微胶囊的流动性用卡耳系数(Carr’s index,C)豪斯比例(Hausner ratio,HR)表示。

式(6)

式(7)

式(8)

式(9)

1.2.6.3 混合油脂微胶囊表面结构观察 在加速电压为5 kV下使用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)对喷雾干燥微胶囊粉末进行观察。

1.2.7 混合油脂微胶囊氧化稳定性 将混合油脂微胶囊样品和混合油脂置于60 ℃条件下进行加速实验,考察样品过氧化值和芯材保留率。

其中过氧化值的测定参照《GB/T 5538-2008 动植物油脂过氧化值测定》。将制备好的微胶囊(表面油So,总油To),通过测定贮藏过程中微胶囊的表面油的变化(Tt)来评价混合油脂微胶囊中油的保留率。

式(10)

1.3 数据统计

所有数据均采用平均值±标准差的方式表示,所有指标均重复测定三次,利用Origin 9.1软件作图,利用SPSS 20.0检验评价样品平均值之间的显著差异(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 美拉德反应产物单因素实验结果

2.1.1 反应时间对美拉德反应产物的影响 随着反应的进行,产物的接枝度上升显著(P<0.05),当反应时间超过120 min后,接枝度有所降低(图1)。这可能是由于反应初期,接枝改变了蛋白质分子的亲水疏水性质,自由氨基逐步暴露,同时持续加热导致蛋白质分子结构伸展,IMO与蛋白质分子逐步结合,接枝度逐渐升高。但是,随着受热时间的延长,可能会导致色氨酸被破坏,接枝受阻;另外,美拉德反应后期部分接枝物可能发生降解[19],褐色物质增多,接枝度下降。所以选择120 min作为反应时间,以保证较高接枝度和较低褐变程度。

图1 反应时间对于接枝度和褐变程度的影响

2.1.2 反应温度对美拉德产物的影响 温度对MRPs的影响结果如图2,当温度为50～80 ℃,接枝度不断升高(P<0.05),一定热处理有利于蛋白质分子中赖氨酸的ε-氨基暴露在表面[20],有利于IMO与其接触,反应迅速。但是80 ℃后,增速明显减慢,褐变程度却增加明显。温度过高时,蛋白质分子之间的相互作用增加,导致蛋白质分子之间聚集不利于反应的进行,接枝度增幅减慢。MRPs色泽加深明显是因为反应后期有色物质增多[21]。因此选择80 ℃为最优温度。

图2 温度对与接枝度和褐变程度的影响

2.1.3 反应pH对美拉德反应产物的影响 由图3可知,随着pH的升高,接枝度和褐变程度不断提高,在pH8.0时接枝度较高,达到20.97%,褐变程度则仅为0.30,因此选择pH8.0作为反应条件。美拉德反应在弱碱性条件下较易发生。pH为9.0时,接枝度增速减慢,可能是因为过碱性条件会造成肽链一级结构破坏,脱氨、脱羧、肽键断裂等变化对反应不利,有毒化合物也偏多,褐变程度升高明显[21]。

图3 pH对与接枝度和褐变程度的影响

2.1.4 底物比例对美拉德反应产物的影响 SC与IMO质量比对MRPs的影响结果如图4。当SC添加量一定的情况下,随着IMO的添加量的提高,接枝度不断增加,主要是因为糖添加量提高,增加了其与氨基的碰撞机率,褐变程度降低,因为IMO呈白色,掩盖了反应的颜色。当IMO添加量进一步提高,增加了体系的黏度,导致分子运动被阻碍,美拉德反应程度减慢,接枝度下降。当SC∶IMO为1∶3时接枝度最高,达到21.81%,褐变程度则仅为0.21。因此选择1∶3作为最优糖添加量。

图4 酪蛋白酸钠与低聚异麦芽糖比例对接枝度和褐变程度的影响

2.1.5 酪蛋白酸钠浓度对美拉德反应产物的影响 随着SC浓度升高,接枝度先升高后下降(图5),在反应比例一定的条件下,SC浓度升高,分子之间碰撞机率增大,因此有利于分子之间的接触,浓度进一步提高,导致黏度增大,分子运动受阻,因此接枝度下降,褐变程度升高主要原因是水分含量过低时长时间加热可能导致焦糖化反应剧烈,颜色加深。因此选择7%为最优浓度。

图5 酪蛋白酸钠浓度对接枝度和褐变程度的影响

综上所述,在SC浓度为7%,SC与IMO比例为1∶3,pH为8.0,80 ℃反应120 min条件下制备的MRPs,其接枝度较高,达到26.30%,褐变程度较低,仅0.29。奥文芳等[22]利用IMO超声辅助接枝改性花生蛋白,通过响应面优化接枝条件后,接枝度为21.30%。李欣等[23]利用IMO接枝改性乳清浓缩蛋白,响应面分析法优化条件参数后复合物的接枝度最大为25.75%。本实验的结果优于文献报道结果。在保证接枝度较高的情况下,制备出褐变程度较低的壁材,有利于提高微胶囊理化性质。

2.2 美拉德反应壁材抗氧化性

按2.1实验结果制备MRPs,进一步从还原力和Fe2+螯合能力分析其抗氧化性能。从图6可以看出,随着MRPs浓度的升高,还原力不断增强,主要原因可能是MRPs中间产物和褐变产物等还原力较强的化合物具有提供氢原子或供电子的能力,阻碍自由基链锁反应,也能与自由基反应成为较为稳定的物质[24],从而将Fe3+铁氰化铁络合物还原成Fe2+。MRPs具有较强的Fe2+螯合能力,在8 mg/mL时,螯合能力达到70.65%,随后逐步趋于平缓,Fe2+螯合能力可能是由MRPs产生的羟基引起的。这与报道MRPs通过螯合体系中的铁离子抑制脂质氧化是一致的[15,25]。

图6 美拉德反应产物抗氧化能力

因此尝试应用MRPs作为壁材包埋混合油脂提高其抗氧化能力同时,在微胶囊应用过程中也能起到很好的抗氧化作用。

2.3 乳化剂对混合油脂微胶囊包埋率的影响

单甘酯为亲油性表面活性剂,蔗糖酯为亲水性表面活性剂。通常一种乳化剂并不能满足所有油脂对亲水亲油平衡值的要求,因此,设计采用两种乳化剂进行复配来解决该问题。由表1可知,当二者复配使用,能够显著降低表面油,包埋率显著提高(P<0.05)。主要原因可能是复配后能降低水相和油相的界面张力,与MRPs在混合油表面协同作用,形成一定的空间位阻、机械及静电屏障,使得乳状液之间的聚结速度减慢,形成稳定的O/W体系,乳状液具有很好的稳定性,从而降低表面油,提高的包埋率[26-27]。

表1 乳化剂对微胶囊包埋率影响结果

2.4 混合油脂微胶囊理化性质

混合油脂微胶囊的理化指标如表2所示。混合油脂微胶囊在载油量为68%条件下,包埋率为95.66%。与此同时,水分含量和水分活度分别为1.38%、0.31,指标良好,达到所需的干燥状态[28]。微胶囊堆积密度为530 kg/m3,是现有报道中较高的,同时也从侧面反映了微胶囊的比表面积较小,圆整度较高[18],与SEM结果一致。研究表明卡尔系数≤10和豪斯比在1.00～1.11表现为流动性非常好[18],由表2知,本研究制得的混合油脂微胶囊卡尔系数和豪斯比例分别为7和1.08,具有良好的流动性能。这些指标对于油脂微胶囊产品的贮藏具有重要的参考意义。

表2 混合油脂微胶囊的物性指标

SEM结果表明,微胶囊外表面结构光滑、圆整、致密,无明显裂缝和凹陷(图7A)。微胶囊内部呈中空结构,空腔表面光滑致密(图7B),中空结构的形成可能是因为雾化时将空气包埋在内,或是喷雾干燥过程中水分蒸发所致。同时可观察到微胶囊囊壁有一定的厚度,油脂分布在囊壁基质中,形成致密的蜂窝状结构(图7B),油滴周围可观察到清晰的界面膜,将油脂包裹住,从而保护油脂不被氧化。庄丰辰制备得到的共轭亚油酸微胶囊同样呈中空结构,油脂分布在囊壁结构中,内表面紧致、光滑,对氧化稳定性起到重要作用[29]。Goyal研究同样发现亚麻籽油微胶囊内部呈中空结构,内表面没有裂缝和气孔存在,从而保护油脂不被氧化[18]。混合油脂微胶囊内外表面都很光滑致密,喷雾干燥过程不会因为脱水而造成内陷结构,而且油滴周围的界面膜也完整地包裹于油滴周围,对油滴的氧化稳定性起到保护作用。

图7 混合油脂微胶囊的扫描电镜图

2.5 混合油脂微胶囊加速实验结果

从图8看出,在第15 d,单纯混合油脂过氧化值为8.01 mmol/kg,超过《GB 15196-2015食品安全国家标准食用油脂制品》中规定值5.12 mmol/kg,而混合微胶囊过氧化值为2.08 mmol/kg,显著低于混合油脂(P<0.05),有着较好的货架期,此时油脂微胶囊保留率为95.44%。从第15～30 d期间,油脂微胶囊过氧化值显著升高(P<0.05),第30 d时达到了9.06 mmol/kg,主要原因是表面油脂在高温条件下发生氧化。与此同时,微胶囊表面油升高了4.63%,保留率下降了6.98%。这表明当微胶囊长时间处于相对高温条件,壁材分子从较稳定的状态变为无定形的状态,使得壁材的包裹性能变差,加速了油脂的流出,表面油脂进一步氧化,同时内部油脂也开始氧化,导致过氧化值迅速升高[30],但是还是显著低于单纯混合油脂过氧化值18.07 mmol/kg(P<0.05)。30 d时微胶囊保留率仍然高于90%,这也说明壁材具有紧密的隔氧性能,同时MRPs具有较好的抗脂质氧化能力[19,31],这一结果与图6中结果是相一致的。因此MRPs制备的混合油脂微胶囊具有良好的贮藏稳定性。

图8 微胶囊60 ℃条件下稳定性

3 结论

采用酪蛋白酸钠与低聚异麦芽糖美拉德反应产物为壁材,酪蛋白酸钠浓度为7%,酪蛋白酸钠与低聚异麦芽糖比例为1∶3,反应时间120 min,反应pH为8,温度为80 ℃,同时采用2%单甘酯与1%蔗糖酯作为复合乳化剂,通过高压均质和喷雾干燥工艺,在油脂载量为68%条件下制备得到的混合油脂微胶囊表面油为3.01%,包埋率可达95.66%。理化性质表明,混合油脂微胶囊具有良好的内外结构,流动性良好,60 ℃加速实验表明油脂微胶囊具有较好贮藏稳定性,油脂保留率较高为90.57%。本研究为利用湿法制备包埋率高,抗氧化性能良好的高载量油脂微胶囊产品提供了一定的工业指导意义。