反枝苋水提物对高脂饮食小鼠的降血脂作用

田 程,王曼力,杜培革,安丽萍

(北华大学药学院,吉林吉林 132000)

随着我国居民生活水平的上升,脂肪在日常饮食中所占比例日益增大,高脂血症患者数量的与日俱增和年轻化发展正严重威胁着人类的生命健康[1]。高脂血症(hyperlipoidemia,HPL)是一种脂质代谢异常的疾病,又被称为脂质异常血症[2]。高脂血症引起的动脉粥样硬化是高血压、高血脂、冠心病、糖尿病、中风等心脑血管疾病发生的主要因素[3-4]。临床上认为高脂血症的主要病因包括:饮食结构的不合理、肥胖症、年龄的增长、不合理的生活习惯等[5-6]。除此之外,激素水平的变化、个体差异、基因异常也是造成高脂血症的原因[7-8]。研究显示,我国的高脂血症发病率已达到10.4%～38%[9]。目前临床上常用的降脂药物有他汀类、纤维蛋白类、胆汁酸类和烟酸类等[10-11],但在长期服药的过程中它们均会产生一系列的副作用,如胃肠道反应、肌病、肝损伤等[12-13]。因此,研制出更加高效、低副作用的新型抗高脂血症药物仍具有重要的临床意义。

反枝苋(AmaranthusretroflexusL,AR),又名苋菜、野苋菜等,为苋科(Amaranthaceae)苋属(Amaranthus)一年生草本植物[14]。反枝苋原产于北美洲[15],因其种植成本低廉且药用价值高而广受学者关注,医者视其为良药,百姓当之为佳蔬[16]。反枝苋资源丰富,田间地头随处可见[17],但目前对其开发和利用还很少。反枝苋含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、生物碱、黄酮类等活性物质,在开发相关保健食品方面有着广阔的研究前景[18]。据报道反枝苋具有止血、消炎、清热止痛等功效[19-20],而其降血脂作用鲜有报道。本研究建立了高脂血症小鼠模型,通过研究反枝苋水提物对小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平的影响,探讨反枝苋对高脂血症模型小鼠的降血脂作用,为进一步开发反枝苋降血脂功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

反枝苋鲜品 吉林长庆药业;SPF级雄性ICR小鼠(4～5 周龄,体重(20.0±2.0) g,50 只,实验动物许可证编号为 SCXK(吉)-2016-0003)、普通饲料、高脂饲料 长春市亿斯实验动物科技有限责任公司;TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、SOD、MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所;化学试剂均为分析纯。

ME104E电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司;MDF-32V超低温冰箱 日本SANYO公司;RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;Milli-Q纯水机 美国Millipore公司;InfiniteM200型全波段酶标仪 瑞士TECAN公司;THZ-C恒温振荡器 太仓市实验设备厂;5430低温高速离心机 德国Eppendorf公司;VS-65UE恒温超声波提取机 无锡沃信仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 反枝苋水提物提取 称量1 kg反枝苋鲜品,以1∶10的比例加入蒸馏水配制成所需的料液比,在恒温超声波提取机中65 ℃进行提取,时间为1.5 h,共提取三次,将三次提取所得滤液合并,在8000 r/min下离心20 min,倒出上清液,抽滤,再转入旋转蒸发仪进行浓缩,待浓缩液为清液1/4时停止浓缩,将浓缩液转入表面皿,置于烘箱中45 ℃干燥,得到反枝苋提取物。

1.2.2 模型的建立及分组给药 选取健康雄性ICR小鼠50只,适应性喂养1周,实验期间小鼠自由饮食、饮水,动物室温度(20±2) ℃,相对湿度50%～60%,将小鼠随机分为五组,每组10只,分别为空白组(Con)、模型组(Mod)、洛伐他汀阳性药对照组(Lovastatin,10 mg/kg/d)、反枝苋低剂量组(AR-L,430 mg/kg/d)、反枝苋高剂量组(AR-H,740 mg/kg/d)。实验通过饲喂高脂饲料[21]建立高脂血症模型,空白组给予普通饲料喂养,造模组给予高脂饲料喂养。建立模型的同时,洛伐他汀组、反枝苋高剂量组、反枝苋低剂量组按相应给药剂量灌胃给药,空白组和模型组给予等体积蒸馏水,连续造模及给药8周。末次给药禁食不禁水12 h后,对小鼠进行称重,眼球取血,并脱颈处死,取出肝、肾、脾于超低温冰箱中-80 ℃保存待测。

1.2.3 小鼠的一般状态观察 每天对动物的自主活动、饮水饮食、粪尿排泄、毛发光泽等基本情况进行观察。

1.2.4 测定小鼠体重及脏器指数 实验期间每周定时称量小鼠体重,对体重变化情况进行记录。取肝、肾、脾用生理盐水冲洗后滤纸吸干称重,计算脏器指数(%)。

脏器指数(%)=脏器质量(g)/体质量(g)×100

1.2.5 小鼠血清生化指标检测 使用摘除眼球的方法收集小鼠血液,以3000 r/min 离心 15 min,取上清,用试剂盒检测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、ALT、AST水平。

1.2.6 肝脏病理学观察 取各组小鼠肝脏用生理盐水冲洗,组织液固定、石蜡包埋及切片后,通过HE染色观察肝脏组织病理学变化[22]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 小鼠的一般状态

模型建立过程中,空白组小鼠体形正常,活动自由,饮食饮水正常,排泄正常,皮毛柔顺有光泽;随时间增加模型组小鼠饮食饮水增多,排泄增多活动缓慢;与模型组比较,洛伐他汀组和反枝苋高、低剂量组的小鼠精神状态良好,活动有所增多。

2.2 对高脂血症小鼠体重、脏器指数的影响

高脂血症及其并发症多与肥胖密切相关,体重的增长直接表明了肥胖的程度[23]。各组小鼠体重变化见表1。结果显示,造模前各组小鼠的体重无显著性差异(P>0.05)。造模后各组小鼠体重均有所增加,空白组增长幅度最小,与空白组相比,模型组小鼠体重极显著增加(P<0.01),且随时间推移模型组体重增长幅度增大;与模型组比较,洛伐他汀组、反枝苋高、低剂量组小鼠体重增长幅度较缓慢,其中洛伐他汀组、反枝苋高剂量组极显著降低(P<0.01),反枝苋低剂量组显著降低(P<0.05)。说明反枝苋水提物能降低高脂血症小鼠的体重。

表1 各组小鼠体质量的变化

脏器指数变化可以判断脏器的损伤情况,脏器指数的增加表示脏器有充血、水肿、增生及肥大等变化,下降则表示脏器萎缩、生长受阻等情况[24]。各组小鼠脏器指数见表2。结果显示,与空白组比较,模型组小鼠的肝脏指数极显著提高(P<0.01),与模型组比较,洛伐他汀组、反枝苋高剂量组的肝脏指数均极显著下降(P<0.01),反枝苋低剂量组显著下降(P<0.05);洛伐他汀组、反枝苋高、低剂量组肾脏指数和脾脏指数与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。

表2 对高脂血症小鼠脏器指数的影响

2.3 反枝苋水提物的降血脂作用

高脂血症通常伴有一系列并发症,如高胆固醇、动脉粥样硬化等[25]。临床上血脂检测的基本项目为 TC、TG、LDL-C 和HDL-C[26]。反枝苋对高脂血症小鼠血脂水平的影响见表3。结果显示,和空白组相比,模型组TC、TG、LDL-C水平均极显著升高(P<0.01),HDL-C水平极显著降低(P<0.01);与模型组比较,洛伐他汀组TC、TG、LDL-C水平极显著降低(P<0.01),HDL-C水平极显著升高(P<0.01);与模型组比较,反枝苋高剂量组TC、TG水平极显著降低(P<0.01),LDL-C水平显著降低(P<0.05),HDL-C水平极显著升高(P<0.01);反枝苋低剂量组 TC、TG、LDL-C水平显著降低(P<0.05),HDL-C水平极显著升高(P<0.01)。结果表明,反枝苋水提物对高脂血症小鼠具有较好的降血脂作用。

表3 对高脂血症小鼠血脂水平的影响

2.4 反枝苋水提物对高脂血症小鼠血清抗氧化水平的影响

SOD是机体抗氧化平衡的重要指标,能减轻生物体在新陈代谢过程中产生的由超氧阴离子自由基导致的脂质过氧化、细胞膜损伤等症状[27]。MDA是长链脂肪酸发生氧化作用后的终末产物,其高低反映氧化应激的严重程度,在组织中的含量变化可间接反映组织氧化程度[28]。

如表4所示,与空白组相比,模型组小鼠血清中SOD水平极显著降低(P<0.01)、MDA水平极显著升高(P<0.01);与模型组比较,洛伐他汀组、反枝苋高剂量组、反枝苋低剂量组血清SOD水平均极显著升高(P<0.01);洛伐他汀组血清MDA水平极显著下降(P<0.01),反枝苋高剂量组MDA水平显著下降(P<0.05),反枝苋低剂量组MDA水平无显著性差异(P>0.05)。结果表明反枝苋水提物能提高高脂血症小鼠血清SOD水平,降低 MDA水平,能提高抗氧化能力。

表4 对高血脂症小鼠血清抗氧化水平的影响

2.5 反枝苋水提物对高脂血症小鼠血清转氨酶活力的影响

肝脏是脂类、糖类以及蛋白质代谢的主要器官[29]。血清中ALT和AST水平是肝功能的代表性指标,可以判断肝脏的损伤程度[30]。反枝苋水提物对高血脂症小鼠肝功能的影响见表5。结果显示,与空白组相比,模型组小鼠血清ALT、AST水平极显著提高(P<0.01);与模型组比较,洛伐他汀组小鼠血清ALT、AST水平极显著降低(P<0.01);反枝苋高剂量组ALT水平极显著降低(P<0.01),AST水平显著降低(P<0.05);反枝苋低剂量组ALT水平极显著降低(P<0.01),AST水平无显著性差异(P>0.05)。

表5 对小鼠血清转氨酶活力的影响

2.6 反枝苋水提物对高脂血症小鼠肝脏病理变化的影响

各组小鼠肝脏组织 HE 染色结果见图1。结果显示,空白组肝小叶结构完整、清晰,肝细胞大小均匀,无明显脂肪变性;与空白组比较,模型组肝细胞内可见大量脂肪空泡,部分肝细胞核因脂肪滴挤压而发生明显偏位,且肝脏脂肪变性程度和脂质沉积较为严重;与模型组比较,反枝苋高、低剂量组和洛伐他汀组肝小叶结构较为清晰,且肝脏脂肪变性程度和肝细胞内脂质沉积明显减轻。以上结果表明,反枝苋水提物可以改善高脂血症小鼠肝脏的病理性变化。

图1 各组小鼠肝脏组织 HE 染色图片(×400)

3 结论

本研究采用饲喂高脂饲料的方法建立高脂血症小鼠模型,发现反枝苋水提物能降低高脂血症小鼠的体重、肝脏指数以及血清中TC、TG、LDL-C、MDA、ALT、AST水平,提高HDL-C、SOD水平,说明反枝苋水提物可以缓解由高脂肪饮食引起的肥胖症状,具有调节血脂和提高机体抗氧化的能力;肝脏病理学观察结果表明,反枝苋水提物可以改善高脂血症小鼠肝脏的脂肪变性程度,具有一定的肝保护作用。

实验创新性地研究了反枝苋水提物对高脂血症小鼠血脂的调节作用,并验证了其降血脂功效。因此在对其进行药效学评价及病理学分析后,实验将接着从代谢组学的分析方法对其信号通路、分子机制等进行更深一步的研究,为药食两用植物反枝苋的开发和利用提供新的研究方向,也为其在保健食品上的应用提供了理论和实践基础。