蒙药扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病的网络药理学研究

黄先菊，董悦，王晶，佟海英，陈路遥,崔竞文

(1 中南民族大学 药学院，武汉430074；2 北京中医药大学 民族医药学研究所，北京 100029)

风湿炎症性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎等多种以炎症为主要诱导致病因素的风湿病，目前此类疾病患病率逐渐增加，在不同的年龄段均可发生，多见于中老年人.扎冲十三味丸又名嘎日迪-13，是蒙药传统方剂之一，本方出自《至高要方》，现已被《药典》收录.其共由制草乌、沉香、丁香、甘草、木香、诃子、肉豆蔻、石菖蒲、煅磁石、制珊瑚、制珍珠、禹粮土、麝香13味药组成，在临床上常用于风湿性关节炎、坐骨神经痛等疾病的治疗[1-4].但扎冲十三味丸治疗风湿炎症性疾病的作用机制尚未见系统阐明.本方组成复杂，由8味植物药、2味动物药及3味矿物药组成，因植物药在方中占比较大，且动物药与矿物药网络预测研究较少，数据库查找相对比较复杂，故本研究仅对扎冲十三味丸中8种植物药进行网络药理学方法分析，从系统、整体的角度将药物与疾病联系起来，预测其植物药成分作用此类疾病的成分靶点，进一步预测其潜在作用机制.

1 方法

1.1 扎冲十三味丸活性成分的筛选

通过药理学分析平台(TCMSP)数据库对扎冲十三味丸中草乌、沉香、木香、甘草、丁香、诃子、肉豆蔻以及石菖蒲8种中药进行成分检索，以口服生物利用度(OB)大于30%及药物相似度(DL)大于0.18为条件，结合文献研究筛选出以上中药的主要活性成分.

1.2 扎冲十三味丸活性成分的靶点预测

将扎冲十三味丸的活性成分输入到 PubChem 数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，得到化合物的“Canonical SMILES”，然后将每个活性成分的“Canonical SMILES”输入 SwissTarget Prediction 平台(http://www.swisstarget prediction.ch/)，物种选择“人类(homo sapiens)”，预测扎冲十三味丸活性成分的潜在作用靶点.

1.3 扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病的相关作用靶点预测

使用GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(http://omim.org/)及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)3个疾病靶点数据库，以“rheumatism”、“rheumatoid”、“arthralgia”及“sciatica”为关键词进行检索，删除重复基因.将获得的疾病靶点与活性成分靶点进行对比，得出共同靶基因.

1.4 扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病的靶蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)网络构建

登 录 Sring 数 据 库(https：//string-db.org/)，输入 1.3 项下收集共同靶基因，设置物种为“人类(homo sapiens)”，最低相互作用阈值为中等置信度(medium confidence)，其余参数保持默认，获取靶蛋白相互作用数据，构建 PPI 网络.通过 Cytoscape 3.2.1软件构建扎冲十三味丸的成分-靶点-疾病网络.

1.5 GO功能富集与 KEGG通路富集分析

将所得的成分与疾病共同靶基因通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(Gene Oncology,GO)分类富集分析和全基因组及代谢途径富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)，通过GO分类富集提取靶标基因或蛋白质的分子功能(Molecular Function,MF)、细胞组分(Cellular Component,CC)，及其所参与的生物学反应(Biological Process,BP)，通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。通过KEGG通路(pathway)富集靶点所涉及的信号通路，以P< 0.01 及基因数≥10为条件进行靶基因筛选，分析扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病主要信号通路及生物过程.

2 结果

2.1 扎冲十三味丸活性成分及靶点筛选

对扎冲十三味丸中8种植物类中药进行活性成分筛选，按照 OB大于30%，DL大于0.18 的筛选条件，一共获得93个活性成分，389个预测靶点.方中各味药活性成分和预测靶点数量见表1，利用 Cytoscape 3.6.1 软件可构建成分-靶点网络图，见图1.

表1 扎冲十三味丸“中药-成分-靶点”基本信息

图1 扎冲十三味丸成分-靶点网络图

2.2 扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病活性靶点预测

使用OMIM等3个疾病数据库，检索到625个相关基因靶点.将389个活性成分靶点与625个疾病靶点进行对比，最终得到61个共有靶点，见表2.并通过 Cytoscape 3.2.1 软件构建扎冲十三味丸的成分-靶点-疾病网络，见图2.

表2 扎冲十三味丸治疗风湿炎症性疾病的作用靶点

图2 扎冲十三味丸成分-靶点-疾病网络图

2.3 共同靶蛋白PPI网络构建

通过 STRING 数据库分析 61个映射得到的风湿炎症性疾病交集靶点，构建预测扎冲十三味丸治疗风湿炎症性疾病靶点 PPI 网络，结果见图3.利用 Cytoscape 3.2.1软件的筛选工具，筛选出该网络中degree值大于30的靶蛋白，分别为凝血因子Ⅹ(F10)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、β2肾上腺素能受体(ADRB2)、前列腺素 G/H 合酶 1(PTGS1)、丝裂原活化蛋白激酶 14(MAPK14).

图3 扎冲十三味丸抗风湿炎症性疾病靶蛋白PPI网络图

2.4 GO功能富集分析

GO功能分析结果显示，以靶点数大于10且P<0.01 为筛选条件，可筛选出参与药效的主要分子功能(MF)有蛋白结合、酶结合及蛋白质均聚活性功能；参与药效的主要细胞组分(CC)有细胞外空间、细胞外区域、细胞表面等；参与药效的主要生物学过程(BP)有炎症反应、免疫反应、NF-kappaB转录因子活性正调控、基因表达正调控、凋亡过程负调控等.其所包含的靶点数见图4.

图4 GO功能富集分析

2.5 KEGG富集分析

KEGG富集分析结果显示，以靶点数大于10且P<0.01为筛选条件，筛选出主要信号通路有18条，作用靶点及其所在信号通路见表3.

表3 KEGG通路富集

结果显示：扎冲十三味丸中活性成分通过作用于人体中风湿炎症性的相关靶点，对体内信号通路如 TNF 信号通路、破骨细胞分化信号通路、Toll样受体信号通路、癌症通路、类风湿性关节炎信号通路、MAPK信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路等产生影响，最终影响疾病的发生发展，见图5.

图5 KEGG通路富集分析

3 讨论

近年来，对于风湿炎症性疾病[5-7]中的RA的相关机制研究较多，研究表明基质金属蛋白酶(MMPs)在RA的发病机制中有着重要作用，MMPs失调会影响肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)等上调或抑制[8-9].还有研究表明JAK2/STAT3信号通路广泛参与了 RA 患者滑膜细胞的增殖、凋亡、炎症反应、血管翳形成和机体的免疫调节等过程[10]，如何通过减少滑膜细胞的增殖、促进滑膜细胞凋亡和抑制对风湿因子的分泌都成为临床治疗中的重要研究方向.扎冲十三味丸在蒙医药理论中，为治疗白脉病之方.白脉病系指赫依、血交博，损及白脉引起的以麻木、肿痛、萎缩、拘挛为特征的病证，又称“白痹”[11-12].本方功能祛风通窍、舒筋活血、镇静安神、除“协日乌素”，能主治半身不遂、左右瘫痪、口眼歪斜、四肢麻木、腰腿不利、语言不清、筋骨疼痛、神经麻痹、风湿、关节疼痛[13].

在现代研究与经典理论背景下，本研究在扎冲十三味丸治疗类似疾病靶点预测方面，得到了大量相关靶点基因，如基质金属蛋白酶系(MMP1/MMP3/MMP8/MMP9)、白介素(IL-2/IL-6/IL-8/IL1A/IL1B)、趋化因子(CXCL10/CXCL11/CCL2)、TNF等炎症相关靶点基因，结果与已有的研究相关疾病结果符合.通过GO功能富集分析发现：与细胞的增殖、凋亡、炎症反应和机体的免疫调节等过程相关的结果共有6条，如炎症反应、免疫反应等，与已有研究也较符合.KEGG通路富集结果显示：扎冲十三味丸可能通过TNF、破骨细胞分化、Toll样受体、癌症、类风湿性关节炎、MAPK、细胞因子受体相互作用等信号通路对风湿炎症性疾病发挥作用，而这类通路与细胞的增殖、凋亡、炎症/免疫反应也密切相关，其结果与GO分析也较为符合.

综上所述，本研究基于网络药理学分析方法[14]得出:扎冲十三味丸治疗风湿炎症性疾病可能是通过TNF、破骨细胞分化等信号通路对细胞增殖、凋亡、炎症反应和机体的免疫调节等过程产生影响而发挥作用，该预测的成分、靶点、途径等具有可信性，可为后续实验验证研究提供较为可靠的依据.