豆豉中丁硫克百威降解菌的筛选及鉴定

郭薇丹,肖 毓,林 欣,罗 煜,付湘晋

(中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004)

丁硫克百威(carbosulfan)是一种氨基甲酸酯类杀虫剂,在水果、蔬菜等经济作物中有着较为广泛的应用[1],其本身是克百威的低毒化衍生物,化学名称为2,3-二氢-2,2-二甲基苯并呋喃-7-基(二丁基氨基硫)N-甲基氨基甲酸酯,分子式为C20H32N2O3S，纯品是褐色粘稠液体,能和二甲苯、丙酮、乙醇互溶,是一种高效广谱的氨基甲酸酯类的杀虫剂[2],丁硫克百威对昆虫具有胃毒和触杀作用[3]。其杀灭虫害的机理主要抑制乙酰胆碱酯酶的活性[4]。其特点是脂溶性强、作用迅速、渗透力强、有较强的残效等[5]。主要用来防治柑橘等水果及棉花、蔬菜、水稻、玉米、甘蔗等多种经济作物上的虫害,对蚜虫的防治效果尤为突出[6]。

丁硫克百威残留属于较突出的非持久性农药污染问题之一,在被重点监测的10余种禁用农药中[7],克百威残留超标率最为严重,在土壤[8]、粮食作物、果蔬、食用菌、茶叶等中均有检出丁硫克百威残留[9],检出率范围为0.96%～56.3%,超标率范围为0.0017%～20.9%[10],是水胺硫磷超标率的2倍,甲基异硫磷超标率的8倍[11]。

农药降解菌的筛选是当前农药降解研究的热点[12]。刘新等[13]从土壤中分离了一株可降解毒死蜱的曲霉和一株既可以降解毒死蜱同时也能降解甲胺磷的木霉。刘智等[14]对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行诱变育种后得到了4株降解谱较宽的菌株,分别对辛硫磷、马拉硫磷、邻氨基酚等有不同程度的降解。Rousseaux等[15]从受污染较严重的土壤中筛选得到25株能对阿特拉津产生降解效应的微生物。郑柳柳等[16]从生产工厂的排污口中筛选出13株细菌,其中一株假单胞菌AD1能在72 h内将浓度为0.3 g/L的阿特拉津几乎完全降解。迟涛等[17]对低温发酵条件下的乳酸菌对有机磷农药的降解作用进行了研究,所选3株植物乳杆菌对乐果、久效磷均有降解促进的作用。陈芳芳[18]对发酵食品中氨基甲酸酯类农药降解进行了研究,发现乳酸菌及霉菌对氨基甲酸酯类农药的降解有促进作用。周欣伟[19]通过研究发酵食品中有机磷农药的微生物降解,发现乳酸菌中磷酸酯酶的活性与有机磷农药的降解促进作用成正比,微生物的发酵过程可以大大提高有机磷农药的降解动力学常数。王晶等[20]研究了3株乳酸菌对7种有机磷农药的降解作用,发现植物乳杆菌1.0343降解作用较强,3株乳酸菌对马拉硫磷、倍硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷的降解作用整体较强,而对敌百虫、久效磷、乐果的作用整体较弱。赵静等[21]从石河子大学农学院试验站采集土样15份,采用富集培养的方法筛选到1株丁硫克百威降解菌,鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。王新等[22]从原沈阳东北制药厂区污染土壤中分离出4株对克百威、毒死蜱具有一定的降解能力的优势菌种,为蜡状芽胞杆菌(Bacilluscircus)。余磊等[23]从杨凌某农药厂排污口处的污泥中分离得到1株能有效降解克百威的细菌,鉴定为假单胞菌属。乔润香等[24]从广东、安徽、贵州、山东、山西、河北、辽宁等地采集土样中筛选得到克百威降解菌株,鉴定为酵母菌[25]。

上述文献表明,目前,丁硫克百威的降解菌主要从土壤中筛选,均不能用于食品中降解丁硫克百威;如果以传统发酵食品为分离材料,则更有可能筛选到可应用于食品的降解菌。本研究以豆豉为分离材料,经过驯化富集、平板划线获得单菌落,采用高效液相色谱法测定降解菌株对丁硫克百威的降解率,筛选降解率高的菌株;并分析这些降解菌株对丁硫克百威降解特性,为开发新型微生物农药降解剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

老一品香浏阳豆豉 从超市中购得;PDA培养基、MHA培养基 青岛海博生物技术有限公司;丁硫克百威(>98%标准品),3羟基-丁硫克百威(>98%标准品) 北京世纪奥科生物技术有限公司;其他试剂 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

LC-20A高效液相色谱仪 配备紫外检测器和LCsolition工作站,日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 无机盐培养基:NaCl 0.5 g,NH4NO31.0 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,K2HPO41.5 g,(NH4)2SO40.5 g,超纯水1 L,调节pH至7.0。

富集培养基:NaCl 1.0 g,KH2PO41.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖1.0 g,超纯水1 L,调节pH至7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,牛肉膏3.0 g,蒸馏水 1000 mL,琼脂18.0 g,调节pH至7.0。

LB液体培养基:NaCl 10.0 g,酵母浸粉 5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,超纯水1 L,调节pH至7.0[22]。

菌株富集培养及菌株降解丁硫克百威实验中,需要在培养基中添加丁硫克百威,添加方法是,培养基灭菌、冷却后在无菌条件下将丁硫克百威加入培养基中。

1.2.2 HPLC法测定丁硫克百威 根据国标(GB 23200.112-2018)进行测定[26]。将老一品香浏阳豆豉研磨后,以二氯甲烷作为提取溶剂提取丁硫克百威[15],采用摇床振荡方式常温提取丁硫克百威10 min。

色谱条件:色谱柱为ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),选择检测条件为柱温30 ℃,流动相为水∶甲醇(10∶90,V/V),流速1 mL/min,检测波长280 nm,进样量20 μL[27]。根据标准品保留时间定性,外标法峰面积定量。将丁硫克百威系列标准溶液分别测定响应的峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,利用峰面积及质量浓度得出丁硫克百威的标准曲线Y=37794X+12151,R2=0.9999。方法检出限0.01 mg/L,定量限0.10 mg/L,回收率在91.51%～97.7%之间,相对标准偏差在2.22%～2.26%,符合国家NY/T 788-2018农药残留试验准则中要求。

1.2.3 降解菌筛选

1.2.3.1 丁硫克百威降解菌株的富集 分别称取豆豉20 g放入装有180 mL富集培养基(丁硫克百威100 mg/L)的三角瓶中,将三角瓶中,置于35 ℃、180 r/min摇床上培养7 d。然后以10%的接种量转接到丁硫克百威终浓度为200 mg/L的新鲜的富集培养液中,继续培养7 d,此后依次逐渐增加富集培养基中丁硫克百威浓度,每次增加量为100 mg/L,直到最后富集培养基中的丁硫克百威浓度达到500 mg/L,最后将获得的富集培养液用于菌株分离[28]。

1.2.3.2 丁硫克百威降解菌株的分离 采用10倍稀释涂布法稀释最终取得的驯化液,在无机盐培养基固体平板上(添加丁硫克百威终浓度为500 mg/L)进行涂布,于30 ℃恒温培养箱中倒置培养3 d,选择在培养基上生长迅速、菌落规则的单菌落划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基以及PDA培养基上,对长出的菌落进行单菌落分离后转接至试管中保存备用。

1.2.3.3 菌株对丁硫克百威的降解 将分离纯化后获得的菌株接种于装有50 mL的LB液体培养基的锥形瓶中,在30 ℃、180 r/min恒温气浴摇床中10 °倾斜振荡培养24 h,将此菌液作为菌株的扩增液。取扩增液在冷冻高速离心机中以4 ℃、10000 r/min条件下离心10 min,倒掉上清液,用灭菌的无机盐液体培养基冲洗沉淀,离心冲洗3次。最后用无机盐液体培养基进行稀释,使菌体浓度达到107CFU/mL,作为种子液备用。取5 mL种子液与50 mL丁硫克百威浓度为500 mg/L的无机盐液体培养基混合,以不接菌为对照,30 ℃、180 r/min摇床培养3、5、7 d,测定丁硫克百威的含量,筛选丁硫克百威降解量高于60%的菌株作为试验菌株,并编号保存。

1.2.4 丁硫克百威降解菌株的鉴定 将筛选出的细菌采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增。交由上海美吉生物医药科技有限公司使用TSINGKE DNA凝胶回收试剂盒(Code No.GE0101)切胶回收目的片段以相应引物测序,将测序结果与NCBI数据库进行比对。通过GenBank下载相关菌株的rDNA序列,与测定的菌株序列仪器进行多重序列比对,利用MEGA4.0软件构建系统发育树。

1.2.5 降解菌对丁硫克百威产物克百威、3-羟基丁硫克百威的降解活性 因为丁硫克百威在酸性环境中易水解成克百威及3-羟基丁硫克百威,在无机盐培养基溶液中加入丁硫克百威至100 mg/L,调节溶液pH至3.0,将无机盐培养基溶液置入恒温摇床,待测得丁硫克百威浓度低于HPLC法检测限后(<0.01 mg/L),将pH调节至7.0,按照1.2.3.3操作加入降解菌株,对照组加入相同体积的无菌水,30 ℃、180 r/min恒温气浴摇床培养3 d,采用HPLC法测定克百威以及3-羟基丁硫克百威[15]。

1.2.6 pH对降解菌降解丁硫克百威的影响 由于丁硫克百威在pH低于3的环境下极易水解,不具有参考价值,因此配制pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,以不加菌作为对照组,30 ℃、180 r/min恒温气浴摇床培养3 d,测定丁硫克百威降解率。

1.2.7 温度对降解菌降解丁硫克百威的影响 在pH=7条件下,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,分别在4、10、20、25、30、35、40 ℃培养3 d,以不加菌作为对照组,测定丁硫克百威降解率。

1.2.8 降解菌降解丁硫克百威动力学特性 将高降解菌株,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,在30 ℃、pH=7的条件下放置在恒温气浴摇床进行处理。分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d时取样进行降解率的测定,进而分析4株菌株的降解动力学,每组设置3个平行,同时设置不加菌作为对照组进行比较。

1.2.9 丁硫克百威降解率的计算

降解率(%)=C1×100/C0

式中,C1:降解后培养液中丁硫克百威浓度(mg/L);C0:培养液中初始丁硫克百威浓度(mg/L)。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据统计、图形拟合、绘图。实验结果通过SPSS Statistics软件进行T检验。使用GraphPad Prism 7进行作图。

2 结果与分析

2.1 降解菌对丁硫克百威的降解效率

通过对分离材料进行培养富集后。对所得菌液进行涂布平板法和平板划线法,分离、纯化,从而得到纯菌落。最终得到14 株降解菌,标记为JJ-1～JJ-14。14种菌株在3、5、7 d时对丁硫克百威的降解率如表1所示。

表1 降解菌株对丁硫克百威的降解率

根据表1中数据进行显著性分析,其中4株菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8的降解率优于赵静等[21]在土壤中所筛选出的降解菌的降解率(63.98%),以及王新等[22]从污染土壤中分离出的降解菌的降解率(60%)。因此选择JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8进行后续研究。

2.2 丁硫克百威降解菌株的鉴定

对筛选所得的14 株中降解率较高的4株菌株进行测序鉴定,初步鉴定菌株JJ-1为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、JJ-4为毕赤酵母(Pichiapastoris)、JJ-5为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、JJ-8为柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。毕赤酵母是许多传统发酵食品中的常见菌株,也已经用于饲料发酵,安全性较高[29]。

图1 菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5及JJ-8的系统发育树

2.3 降解菌对丁硫克百威水解产物的影响

降解菌对克百威及3-羟基克百威的降解效果如图2所示。通过比较对照组数据可以得出四株菌株均对克百威有降解效果(降解率51.39%～57.14%,无显著差异),但只有菌株JJ-4对克百威及3-羟基克百威有较好的降解效果,JJ-4在3 d时对3-羟基克百威降解率达到73.24%。

图2 降解菌对丁硫克百威水解产物的影响

2.4 pH对降解菌降解丁硫克百威的影响

通过图3可以发现丁硫克百威自身水解速率随pH的降低而加快,而在pH偏中性或碱性环境下,丁硫克百威比较稳定,pH对水解效果的影响与罗俊凯等[30]的研究相同。在pH偏碱性时,菌株JJ-1以及JJ-5不能表现出很好的降解活性。同时可以看出菌株JJ-4在pH5～9的范围内均有较好的降解效果。

图3 pH对降解率的影响

2.5 温度对降解菌降解丁硫克百威的影响

由图4可知,丁硫克百威自身的水解速率随温度的升高而加快,在高温环境下丁硫克百威容易进行水解,温度对水解效果的影响与罗俊凯等[30]的研究相同。在低温环境下时(4 ℃),菌株JJ-1对丁硫克百威有15%左右的降解,其它3个菌株均不能表现出很好的降解效果,这是由于低温环境影响了降解菌的生物活性。而在40 ℃时,菌株JJ-4、JJ-8表现出了超出丁硫克百威自身水解的降解效果。扣除丁硫克百威自身水解,JJ-1、JJ-5、JJ-8菌株在30 ℃左右时表现出最高降解效率,菌株JJ-4的降解效率在35 ℃左右最高,达72.96%,超出丁硫克百威自身降解率(41.68%)。

图4 温度对降解率的影响

2.6 降解菌降解丁硫克百威的动力学特性

通过计算9 d的降解率得出4种菌株的降解率曲线,如图5所示,动力学拟合方程见表2。

表2 降解菌株对丁硫克百威的降解动力学方程式及其参数

图5 降解菌株对丁硫克百威的降解率曲线

在pH=7,30 ℃条件下,丁硫克百威的自然降解动力学方程为Ct=10.872e0.1692d,相关系数r=0.9980,水解速率常数为0.1692,水解半衰期9.01 d。在菌株JJ-1作用下丁硫克百威的半衰期在4.06 d,在菌株JJ-4作用下丁硫克百威的半衰期在3.20 d。

3 结论

获得4株能够高效降解丁硫克百威及其代谢产物的菌株,菌株JJ-1为为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida),JJ-4为毕赤酵母(Pichiapastoris),JJ-5为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens),JJ-8为柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。

4株降解菌株对克百威都有一定降解效果,JJ-4对3-羟基克百威也有较好的降解效果,3 d时的降解率达73.24%。

菌株JJ-4在pH范围5～9之间均表现出良好的降解效果,pH=8时对丁硫克百威降解率达到50.87%。35、40 ℃时JJ-4对丁硫克百威降解率超过78%,能很好的适应高温环境。

菌株对丁硫克百威的降解速率符合一级动力学方程。菌株JJ-4降解丁硫克百威的动力学方程是Ct=36.189e0.1009d(R2=0.9912),半衰期3.20 d。