白花蛇舌草-半枝莲药对组分对结肠腺癌Lovo细胞生物学行为的影响

2020-10-23包萨如拉安桂凤萨如拉苏步德格日乐

天津医药 2020年10期

包萨如拉，安桂凤，萨如拉，苏步德格日乐

大肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，目前已成为我国发病率上升最快的消化道恶性肿瘤［1］。据2018年全球癌症数据调查显示，大肠癌的发病率居第4位，死亡率居第2位［2］。结、直肠癌均属于大肠癌，根治性手术切除是目前最有效的治疗方法［3］，但患者就诊时多为中、晚期，癌细胞转移侵犯邻近组织，导致根治率低［4］。尤其是无法手术的患者，其5年生存率＜5%［5］。因此,对于大肠癌的治疗及疗效的提高，除了早期干预外，还应从其发生、浸润和转移的分子调控机制方面寻求新的治疗靶点和药物。白花蛇舌草和半枝莲均有抗炎、活血化瘀、抗癌和疗毒敛疮的作用，在中药配伍中常作药对使用［6-7］。目前白花蛇舌草-半枝莲药对常融入方剂中，如“重建中气抗癌汤I号”等［8］。此外，部分基础研究证实，白花蛇舌草-半枝莲药对提取物可抑制胃癌［9］、肝癌［10］和乳腺癌［11］细胞的增殖，降低迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡。目前对白花蛇舌草-半枝莲抑制大肠癌细胞作用的报道较少。本研究旨在探讨白花蛇舌草-半枝莲对人结肠腺癌Lovo细胞生物学行为的影响，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞及试剂人结肠腺癌Lovo细胞购自美国ATCC公司。白花蛇舌草、半枝莲购自内蒙古民族大学医院中药房，白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草，半枝莲为唇形科植物半枝莲的干燥全草。RPMI 1640培养基（美国Gibeo公司）；二甲基亚砜（美国Sigma公司）；兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、兔抗人苏氨酸激酶（Akt）多克隆抗体、兔抗人血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）多克隆抗体、兔抗人B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）多克隆抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白（Bax）多克隆抗体、兔抗人Grb2相关结合蛋白1（Gab1）多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗体、兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆抗体（英国Abcam公司）；山羊抗兔过氧化物酶二抗（北京康为世纪公司）；MTT检测试剂盒（美国Sigma公司）；Transwell小室（美国Millipore公司）；BCA试剂盒（上海威奥生物科技有限公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天公司）。

1.2仪器 WD-9413B型凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）；BX53型荧光显微镜（日本Olympus公司）；SD Cell型转移电泳槽（美国Thermo公司）；VE-180型垂直板电泳装置（上海天能科技有限公司）；muLISKAN-MK3酶标仪（美国Bio-rad公司）；Titan G260-300型透射电镜（日本日立电子公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（贝克曼公司）。

1.3白花蛇舌草-半枝莲组分制备白花蛇舌草-半枝莲组分制备方法参考文献［12］，将白花蛇舌草、半枝莲按质量1∶1比例取材后进行3次煎煮，无菌纱布滤渣，获得水提物，后取适量浸膏用石油醚回流脱脂，再以乙酸乙酯进行多次萃取，浓缩干燥后获得白花蛇舌草-半枝莲药对乙酸乙酯组分，并计算得率。得率=目标物质含量/原料物质含量×100%。根据参考文献［12］对白花蛇舌草-半枝莲乙酸乙酯组分进行检测：取白花蛇舌草-半枝莲乙酸乙酯浸膏及对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素样本，加入1 mL甲醇，充分溶解后过滤、离心，并采用超高效液相色谱（UPLC）进行分析。UPLC色谱条件：柱温40℃，流动相为乙腈（C）-0.1%甲酸（D），梯度洗脱（0～20 min，5%C和95%D；20～22 min，100%C；22～25 min，5%C和95%D）。

1.4细胞培养与分组取复苏后的人结肠腺癌Lovo细胞接种于96孔板内，培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基中。细胞设对照组以及低、中、高剂量白花蛇舌草-半枝莲药对干预组，分别予以白花蛇舌草-半枝莲药对0、10、30、50 mg/L处理。细胞培养条件为：37 ℃，5%CO2，隔天换液1次。各组Lovo细胞均培养72 h，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.5MTT检测细胞增殖能力各组细胞培养24、48、72 h后每孔加入MTT溶液50 μL，孵育4 h，加入二甲基亚砜200 μL，每组6个复孔，酶标仪调定波长为490 nm进行检测，以每组细胞光密度（OD）值反映各组细胞增殖能力，计算增值抑制率。增殖抑制率=［（1-实验组OD值）/对照组OD值］×100%。

1.6流式细胞术检测细胞周期取培养48 h的细胞，以0.25%胰酶消化，1 500 r/min离心10 min，弃上清，PBS洗2次，加70%预冷乙醇溶液，振荡，4℃固定过夜。PBS洗2次，室温条件下加碘化丙啶（PI）30 μL/管染色20 min，上机检测各组细胞周期的分布情况。

1.7Transwell小室检测细胞侵袭能力将50 mg/L的Matrige基质胶（1∶8稀释）平铺在孔径8 μm的Transwell小室聚碳酸滤膜的上室内表面，干燥过夜。在各组Lovo细胞培养48 h后，取约5×104个细胞置于Transwell的上室中，滴入无血清培养液重悬细胞，然后移至Transwell小室中层。培养24 h后，经PBS冲洗，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下计数穿膜的细胞个数，实验独立重复6次，以视野内平均细胞数表示细胞侵袭能力。

1.8划痕实验检测细胞迁移能力用记号笔在6孔板背面划多条直线，取培养48 h的各组细胞，每孔铺1×106个细胞，用1 mL枪头垂直于板底和直线划痕，记录宽度拍照。加入无血清DMEM培养基继续培养24 h，PBS冲洗3次记录细胞划痕宽度，实验独立重复6次，计算细胞划痕闭合率。划痕闭合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.9TUNEL法检测细胞凋亡取对数生长期的各组Lovo细胞，将1×106个细胞接种于6孔板中，经过0.1%Trition X-100透化后，加入3%H2O2200 μL，PBS漂洗后加入蛋白酶K灭活DNA和RNA，最后加入TUNEL工作液，恒温箱中避光孵育60 min。取出后经PBS冲洗3次加入DAPI反应液，反应20 min后冲洗封片。应用荧光显微镜观察细胞，绿色代表已凋亡细胞，蓝色代表存活细胞，实验独立重复6次。凋亡指数＝各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%。

1.10Western blot法检测Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表达取各组待测样品12 μL，蛋白Marker 5 μL，SDS-PAGE进行电泳，转膜，封闭，加入Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2及Bax蛋白一抗（均为1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗（1∶700稀释），室温孵育2 h，洗膜，ECL显像，用凝胶图像处理系统分析表达水平，实验独立重复6次。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.11统计学方法采用SPSS 19.0软件对数据进行处理。符合正态分布的计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白花蛇舌草-半枝莲药对组分制备结果白花蛇舌草-半枝莲药对经乙酸乙酯萃取后得率为0.61%。UPLC分析结果显示，白花蛇舌草-半枝莲药对中主要含有对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素和芹菜素4种化合物，符合白花蛇舌草-半枝莲药对乙酸乙酯组分成分。见图1。

2.2 4组细胞增殖抑制率变化与对照组相比，培养24、48及72 h后，低、中、高剂量组细胞的增殖抑制率增加，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.3 各组Lovo细胞周期分布变化与对照组相比，低、中、高剂量组培养48 h后，G1期肿瘤细胞比例增加，S期和G2期细胞比例减少，且呈剂量依赖性（均P＜0.05）。见图2、表2。

Fig.1 UPLC analysis of the components of Hedyotis diffusa-Sculellaria barbata图1 白花蛇舌草-半枝莲药对组分UPLC分析谱

Tab.1 The proliferation inhibition rates in the four groups of Lovo cells表1 4组Lovo细胞增殖抑制率变化（n=6，±s）

＊＊P＜0.01，a与对照组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05，表2～5同

增殖抑制率（%）组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F 24 h 1.26±0.15 6.05±0.33a 15.84±2.40ab 20.37±3.45abc 250.322＊＊48 h 2.45±0.31 10.33±1.32a 20.54±1.69ab 30.86±4.98abc 117.240＊＊72 h 4.32±0.57 15.05±1.34a 35.43±2.98ab 40.40±3.87abc 252.602＊＊

Fig. 2 The pictures of cell cycle distributions in the four groups of Lovo cells图2 4组Lovo细胞细胞周期分布图

2.4 4组Lovo细胞侵袭、迁移及凋亡水平的变化比较与对照组相比，低、中、高剂量组培养48 h后侵袭细胞数和划痕闭合率明显减少，细胞凋亡指数增高，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图3～5。

Tab.2 Changes of cell cycle distributions in the four groups of Lovo cells表2 4组Lovo细胞细胞周期分布变化（n=6，%，±s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F细胞周期G1 32.45±4.48 40.38±3.99a 50.69±3.94ab 59.37±4.10abc 50.538＊＊S 17.64±2.86 13.99±1.50a 12.04±1.34ab 10.25±1.23abc 14.128＊＊G2 49.91±3.02 45.93±2.13a 36.57±3.06ab 29.68±2.23abc 66.347＊＊

Tab.3 Changes of invasive cell number,scratch closure rate and apoptosis index in the four groups of Lovo cells表3 4组Lovo细胞侵袭细胞数、划痕闭合率及凋亡指数变化（n=6，±s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F侵袭细胞数（个/视野）118.65±5.87 110.26±5.37a 69.85±6.16ab 44.67±4.95abc 431.360＊＊划痕闭合率（%）93.47±6.41 84.49±5.12a 71.34±5.79ab 49.17±2.95abc 128.317＊＊凋亡指数（%）7.62±0.67 9.92±1.16a 16.56±2.16ab 28.17±3.95abc 139.478＊＊

2.5 各组细胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表达检测结果与对照组相比，低、中、高剂量组细胞中Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9及Bcl-2表达降低，Bax表达升高，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（均P＜0.05）。表4、5，见图6。

Tab.4 Expressions of Gab1,VEGFR-2,PI3K and Akt proteins in the four groups of Lovo cells表44组Lovo细胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt蛋白表达结果（n=6，±s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F Gab1/β-actin 1.15±0.11 0.72±0.07a 0.54±0.07ab 0.31±0.04abc 150.650＊＊VEGFR-2/β-actin 0.91±0.10 0.72±0.07a 0.64±0.05ab 0.37±0.04abc 72.460＊＊PI3K/β-actin 1.26±0.12 0.99±0.09a 0.76±0.08ab 0.54±0.04abc 95.084＊＊Akt/β-actin 0.94±0.06 0.72±0.06a 0.59±0.09ab 0.39±0.06abc 55.984＊＊

Fig.3 Changes of the invasion ability in the four groups of Lovo cells(×400)图3 4组Lovo细胞侵袭能力变化（×400）

Fig.4 Changes of the migration levels in the four groups of Lovo cells(×400)图4 4组Lovo细胞迁移能力变化（×400）

Fig.5 Changes of the apoptosis rate in the four groups of Lovo cells(TUNEL staining,×200)图5 4组细胞凋亡水平变化（TUNEL染色，×200）

3 讨论

王单单等［12］通过中药系统药理学分析平台，预估白花蛇舌草-半枝莲药对中19种成分可影响大肠癌细胞33个靶点及25条信号通路，有望成为大肠癌治疗的辅助药物。本实验采用0、10、30、50 mg/L的白花蛇舌草-半枝莲药对组分干预人结肠腺癌Lovo细胞，发现白花蛇舌草-半枝莲药对组分可增加Lovo细胞G1期比例，诱导细胞凋亡，并抑制Lovo细胞增殖、侵袭、迁移能力，且具有剂量依赖性。笔者推测白花蛇舌草-半枝莲药对组分可将Lovo细胞阻滞于G1期，抑制结肠腺癌Lovo细胞增殖；并通过诱导癌细胞的凋亡，降低其迁移和侵袭能力。

Tab.5 Expressions of MMP-9,Bcl-2 and Bax proteins in the four groups of Lovo cells表5 各组Lovo细胞MMP-9、Bcl-2及Bax蛋白表达（n=6，±s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F MMP-9/β-actin 1.17±0.09 0.94±0.06a 0.71±0.06ab 0.52±0.04abc 162.537＊＊Bcl-2/β-actin 0.96±0.067 0.74±0.06a 0.51±0.04ab 0.32±0.03abc 256.348＊＊Bax/β-actin 0.25±0.04 0.43±0.03a 0.59±0.04ab 0.71±0.04abc 261.073＊＊

Fig.6 Electrophoretic diagram of Gab1,VEGFR-2,PI3K,Akt,MMP-9,Bcl-2 and Bax in the four groups of Lovo cells图6 4组Lovo细胞Gab1、VEGFR-2、PI3K、Akt、MMP-9、Bcl-2及Bax表达

Gab1是一种多底物适配蛋白，Gab1在N端附近具有高度保守的富含脯氨酸PH结构域，且含有多个SH2和SH3结合位点和Met偶联序列［13］。PH结构域能够结合细胞膜上的PIP3蛋白，将Gab1锚定在细胞膜内表面，进一步增加Gab1与受体相互作用的机会。SH2结合位点可以绑定包含YXXP序列的信号分子，如PI3K亚基p85、SHP2、PLC-γCrk，发挥生物效应［14］。Gab1与肿瘤特别是胃肠道肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关［15］。Bai等［16］证实大肠癌组织中高表达Gab1，并且Gab1与患者癌组织分化和淋巴转移相关。VEGFR-2可以增加MMP-9的表达，降解细胞外基质（ECM）和基底膜的主要成分胶原Ⅳ，促进肿瘤细胞转移及侵袭能力，并与肿瘤血管和淋巴系统的生成有关［17-18］。PI3K/Akt信号通路通过多种机制调控体内肿瘤的生物学行为，与大肠癌细胞侵袭和凋亡、血管及淋巴管形成、肿瘤预后等密切相关［19-21］。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，Bax与Bcl-2同族，具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，Bcl-2与Bax比例影响肿瘤细胞的凋亡走向［22］。Gab1可介导VEGFR-2激活PI3K/Akt信号通路，并增加PI3K/Akt通路的活化程度，促进细胞侵袭，而MMP-9是PI3K/Akt重要的下游靶蛋白［23-25］。

为了进一步探究白花蛇舌草-半枝莲对结肠腺癌Lovo细胞生物学影响的具体机制，笔者对Lovo细胞中Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信号通路蛋白及MMP-9、Bax和Bcl-2的表达进行检测。发现白花蛇舌草-半枝莲药对组分低、中、高剂量组细胞中VEGFR-2、Gab1、PI3K、Akt、Bcl-2及MMP-9表达降低，Bax表达升高，呈剂量依赖性。结合Lovo细胞生物学行为实验结果，笔者分析认为白花蛇舌草-半枝莲药对组分可能通过抑制Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信号通路表达，抑制下游MMP-9表达，使肿瘤细胞难以降解ECM和基底膜，削弱Lovo细胞侵袭和迁移能力；同时，PI3K/Akt通路的低表达，促使Bcl-2/Bax失衡，诱导细胞凋亡，与TUNEL检测结果一致。

综上所述，白花蛇舌草-半枝莲药对组分可抑制结肠腺癌Lovo细胞增殖、迁移及侵袭能力，并诱导细胞凋亡。其机制可能与阻滞肿瘤细胞分裂周期、抑制Gab1/VEGFR-2/PI3K/Akt信号通路有关。