白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞放疗增敏的作用及其机制

刘 畅,郑荣华,温 武,朱敏辉*

(1上海市中医药大学附属龙华医院耳鼻喉科,上海 200032;2第二军医大学附属长海医院耳鼻喉科;*通讯作者,E-mail:zhuminhui197915@163.com)

鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤,由多种因素诱发,如遗传变异、环境因素和Epstein-Barr(EBV)病毒感染[1]。据GLOBOCAN数据库显示,2012年全世界报告8万多例鼻咽癌新病例,其中中国、东南亚、北非和太平洋岛屿的发病率最高。与大多数其他恶性肿瘤不同,由于鼻咽癌的解剖位置和放射敏感性,放疗是鼻咽癌的主要治疗方法[2]。白花蛇舌草是茜草科植物之一,是我国古代著名的药用植物。现有证据表明白花蛇舌草成分具有多种生物功能,包括抗血管生成、抗炎、抗氧化、促凋亡等[3]。更重要的是,白花蛇舌草提取物在许多临床前癌症研究中显示出显著的抗癌活性[4,5]。然而,白花蛇舌草提取物在鼻咽癌细胞中潜在作用的相关研究在文献检索范围内鲜有报道。本研究拟在体外进行白花蛇舌草提取物对鼻咽癌细胞CNE-1放疗增敏的实验研究,以探讨白花蛇舌草提取物在放疗增敏中的作用机制,从而为临床鼻咽癌放疗增敏提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

白花蛇舌草水提物:白花蛇舌草(江西天师中药集团余江制药厂)30 g加蒸馏水3 000 ml温火煎煮60 min,加热沸腾30 min,网筛过滤去渣,离心取上清液浓缩为300 ml,0.2 μm过滤除菌,备用。RPMI1640培养基和胎牛血清均购自Gibco公司;抗LASP1抗体和抗β-actin抗体和辣根过氧化物标记的二抗购自英国Abcam公司;BCA法蛋白浓度检测试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒和CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

鼻咽癌细胞系CNE-1购自中国科学院上海细胞研究所。细胞培养于添加有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 U/ml)的RPMI1640培养基中,且在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 细胞增殖检测

采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。将处于对数生长期的鼻咽癌细胞CNE-1制成细胞悬浮液,以1×103个/孔细胞的量接种至96孔板内,重复3孔。培养24 h后,各孔加入不同浓度白花蛇舌草(100,200,400 μg/ml)继续培养24,48,72 h,或者不同剂量的射线(2,4,6,8 Gy)照射24 h。离心弃去培养液,每孔加入含10%的CCK-8试剂的培养液继续震荡培养20-30 min,450 nm处检测各孔OD值并记录结果。细胞活性=(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。细胞生长抑制率=1-肿瘤细胞存活率(%)。根据此实验结果,我们进一步选择2 Gy射线及400 μg/ml白花蛇舌草水提物处理细胞,将细胞分为空白对照组、射线组、白花蛇舌草组、射线+白花蛇舌草组。

1.4 细胞凋亡检测

对数生长期的CNE-1细胞(1×103个/孔)接种到6孔细胞培养板中,随机分为4组:空白对照组、射线组、白花蛇舌草组、射线+白花蛇舌草组。细胞分别经过白花蛇舌草、放射线以及白花蛇舌草和放射线联合处理24 h后,消化离心收集细胞,加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和10 μl的PI染料,轻轻混匀后室温避光孵育10 min,于流式细胞仪检测。

1.5 RNA提取与荧光定量PCR

CNE-1细胞随机分为4组:空白对照组、射线组、白花蛇舌草组、射线+白花蛇舌草组。采用TRIzol法提取各组细胞中总RNA,检测RNA的纯度及浓度。以总RNA为模板,利用逆转录试剂盒扩增得到cDNA。采用SYBR Green PCR试剂盒,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参进行荧光定量PCR检测LASP1 mRNA水平。根据2-ΔΔCt方法计算LASP1的相对表达水平,每组设置3个平行。RNA提取、逆转录及定量PCR条件与反应体系均按照对应说明书进行操作。

1.6 Western blot分析

收集各组细胞培养液,离心后加入蛋白裂解液反应30 min,提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度,采用SDS-PAGE分离等量的蛋白质,采用湿法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。经5%脱脂牛奶/TBST封闭,一抗过夜孵育后,TBST清洗后加入二抗,室温下孵育90 min。加入ECL显色剂后置于凝胶成像仪检测目标蛋白水平。

1.7 统计学分析

结果以均数±标准差表示,采用SPSS17.0统计学软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞CNE-1的抑制作用

鼻咽癌细胞CNE-1经不同浓度(100,200,400 μg/ml)白花蛇舌草水提物分别处理24,48,72 h后,CCK-8实验检测白花蛇舌草对CNE-1细胞的抑制作用。结果显示,随着白花蛇舌草水提物浓度增加,其对CNE-1细胞活性的抑制率逐渐增加(见图1),表明白花蛇舌草水提物对CNE-1细胞活性的抑制具有浓度依赖性。在同一浓度下随着处理时间的延长,其对CNE-1细胞活性的抑制率也逐渐增加(见图1),表明白花蛇舌草水提物对CNE-1细胞活性的抑制具有时间依赖性。后续实验中,我们选择400 μg/ml白花蛇舌草水提物处理细胞24 h,研究其在射线影响鼻咽癌细胞活性中的作用。

与100 μg/ml相比,*P<0.05;与24 h相比,#P<0.05图1 白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞CNE-1的抑制作用Figure 1 The effect of Hedyotis Diffusa on CNE-1 cell proliferation

2.2 白花蛇舌草水提物增强射线对细胞活性的抑制

CNE-1细胞经2,4,6,8 Gy射线单独处理24 h后,CCK-8试验检测细胞活性发现,与对照组相比,2,4,6,8 Gy射线照射后相对细胞活性分别为94.7%±1.6%,85.0%±1.7%,78.2%±1.6%,71.6%±3.1%,表明射线单独处理细胞可抑制细胞活性。随后,将CNE-1细胞分为4组:对照组、射线组、白花蛇舌草水提物组、射线+白花蛇舌草组,然后检测白花蛇舌草水提物结合射线对细胞活性的影响。结果显示射线联合白花蛇舌草水提物处理细胞后,对细胞活性的抑制作用显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

与对照组相比,*P<0.05;与射线组相比,#P<0.05图2 白花蛇舌草水提物联合射线对细胞活性的影响Figure 2 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell proliferation

2.3 白花蛇舌草水提物结合射线对细胞凋亡的影响

将CNE-1细胞分为4组:对照组、射线组、白花蛇舌草水提物组、射线+白花蛇舌草水提物组,流式细胞仪检测细胞凋亡。射线和白花蛇舌草单独处理细胞时,均可促进细胞凋亡,联合处理显著增加细胞凋亡率,差异具有统计学意义(见图3)。

图3 白花蛇舌草水提物结合射线对细胞凋亡的影响Figure 3 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell apoptosis

2.4 白花蛇舌草水提物结合射线对LIM和SH3蛋白1(LASP1)蛋白表达的影响

荧光定量PCR检测和Western blot分别检测不同处理组细胞中LASP1 mRNA和蛋白表达变化。结果显示,射线和白花蛇舌草水提物单独处理细胞可不同程度增加LASP1的表达,联合处理可显著增加LASP1的表达水平,差异均具有统计学意义(P<0.05,见图4)。

与对照组相比,*P<0.05;与射线组相比,#P<0.05图4 白花蛇舌草水提物结合射线对LASP1 mRNA水平和蛋白表达的影响Figure 4 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on LASP1 mRNA and protein levels

3 讨论

鼻咽癌是鼻咽组织形成的恶性肿瘤,是一种罕见的头颈癌,在中国南部和东南亚尤为常见。与其他以手术为主的头颈部肿瘤不同,鼻咽癌的主要治疗策略是放疗。放射治疗、人群筛查和有效的全身用药等方面的进展显著降低了鼻咽癌的死亡率。特别是调强适形放疗的应用,大大改善肿瘤控制,降低毒副作用[6]。然而,耐辐射诱导的局部失效仍然是鼻咽癌治疗失败的主要原因。此外,对治疗的反应因肿瘤细胞遗传背景的个体间差异和变异而异。例如,总剂量为70-80 Gy射线照射后,部分患者鼻咽癌残余病灶仍然存在,而其他患者仅照射40 Gy后,鼻咽癌完全缓解。因此,鼻咽癌的耐药机制亟待阐明,以制定耐药逆转策略和增加生物标志物以指导个体化治疗。

草药已在亚洲多个国家得到应用,已有大量研究报道天然草药提取物的体外抗癌活性。白花蛇舌草是一种有价值的具有抗癌活性的传统药用植物。研究发现,白花蛇舌草可显著抑制肝癌细胞增殖、转移和促进凋亡,且白花蛇舌草通过调节肝功能、葡萄糖代谢和转移来增强抗肿瘤作用[7,8]。白花蛇舌草通过抑制基质金属蛋白酶-9和细胞间黏附分子-1的表达和ERK1/2 MAPK途径抑制乳腺癌MCF-7细胞的转移潜能,诱导其凋亡[9]。近来,Song等[10]通过网络药理学方法探讨白花蛇舌草对前列腺癌的潜在作用机制,发现白花蛇舌草可靶向多种分子抑制前列腺癌,如VEGFA、STAT3和CXCL8等。还有研究发现,白花蛇舌草的多糖可通过EGFR/Akt/ERK信号通路抑制肺腺癌A549细胞的转移潜能[11]。然而,白花蛇舌草在鼻咽癌细胞中的作用尚不清楚。本研究结果发现,随着白花蛇舌草水提物浓度增加和作用时间延长,其对CNE-1细胞活性的抑制率逐渐增加,表明白花蛇舌草水提物对CNE-1细胞活性的抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。射线单独处理细胞可抑制细胞活性,而射线联合白花蛇舌草水提物处理细胞,对细胞活性的抑制作用显著增强。射线和白花蛇舌草单独处理细胞时,均可促进细胞凋亡,联合处理显著增加细胞凋亡率。进一步研究发现,射线和白花蛇舌草水提物联合处理显著增加LASP1的表达水平。也有研究表明,白花蛇舌草对鼻咽癌细胞株CNE1有显著的增殖抑制作用,其中以亲脂类提取物的作用最为明显[12]。

LIM和SH3结构域蛋白1(LASP1)是LIM蛋白和肌动蛋白结合蛋白家族的成员,是依赖cAMP和cGMP的信号蛋白,可以在细胞膜延伸处与肌动蛋白骨架结合。最近的研究表明,LASP1在多种恶性肿瘤中表达上调,如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和肾癌[13]。LASP1已被证明与鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭有[14,15]。本研究结果显示,射线和白花蛇舌草水提物联合处理可显著增加LASP1的表达水平,表明LASP1可能参与白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞放疗增敏的作用。

综上所述,本研究证实白花蛇舌草对鼻咽癌细胞具有放射增敏作用,且LASP1可能参与白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞放疗增敏的作用。