肾移植术后天然抗体对受者预后影响的相关性研究

刘伟，赵杰，宋广平，刘伟，赵一贺，李代红 （.天津市第一中心医院输血科， 天津 3009；.天津市第一中心医院移植外科，天津 3009）

肾移植是目前终末期肾病患者最佳的肾脏替代治疗方式，能够提高患者的生活质量和预期寿命。抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）是危害肾移植长期预后的一个主要原因，也是导致移植肾加速失功的重要推动因素。目前，抗体在实体器官移植排斥反应中的作用研究主要集中在针对移植组织上的同种异基因靶器官的抗ABO血型和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）特异性抗体上。有研究报道，MICA［1］、AT1R［2-4］、ETAR［5-6］和LG3［7］等非HLA 抗体会导致患者产生AMR。

天然抗体（natural antibodies，Nabs）主要结合一些氧化应激下脂质过氧化产生的氧化相关抗原，这些抗原包括自身抗原和外来抗原，也包括凋亡细胞的表面抗原。过氧化产生高活性产物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA），与蛋白质或脂质共价结合形成了Nabs 识别的新表位［8］。在器官移植中，移植物的缺血/再灌注、移植物损伤、慢性排斥反应等均有氧化应激现象，使Nabs 结合到移植物中，最终造成移植物损伤。同时，Nabs 在维持体内稳定和免疫保护方面也具有重要作用，但在异体移植损伤中的作用机制仍不十分明确。本研究通过回顾性分析肾移植患者对MDA 有反应的IgG Nabs 抗体的产生情况，从而探讨其与移植物存活、肾组织活检的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料：选取2015 年1 月— 2019 年6 月天津市第一中心医院行同种异体肾移植术患者44 例，其中男性36 例，女性8 例，平均年龄为（45.8± 10.9）岁。入选标准：① 所有受者移植术前进行补体依赖淋巴细胞毒试验结果为阴性； ② 术后均接受钙调磷酸酶抑制剂（环孢素或他克莫司）为主的免疫抑制方案；③ 术后能够定期随访，且各种资料完整；④ 所有患者均发生AMR。

1.2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测Nabs 抗体

1.2.1 血清IgG 的纯化：根据试剂说明书，使用瓜子凝胶IgG 纯化试剂盒（Thermo Science，Rockford，IL）纯化患者血清标本中的IgG。血清样品使用缓冲液稀释为1：10，与甜瓜凝胶孵育5 min，然后通过离心从凝胶中洗脱IgG。

1.2.2 MDA 反应性评估：取1 mol/L 1，1，3，3-四甲氧基丙烷（湖北巨胜科技有限公司）2 ml 加入到8 ml 96 mmol/L HCl 中，37℃水解10 min，然后用1 mol/L NaOH 中和，调节pH 值到7.2 ～ 7.4。取10 ml MDA 与50 ml BSA （2 mg/ml） 溶液在37℃孵育3 h，然后4℃下用PBS 进行广泛透析72 h，得到MDA-BSA 包被抗原。然后，将高结合96 孔板包被 10 μg/ml MDA 修饰的BSA，4℃过夜。用添加0.5%水解酪蛋白的PBS 缓冲盐水在室温下封闭平板1 h。待检血清用0.5%明胶的PBS 缓冲盐水稀释4 倍， 50 μl/孔加入到包被孔中，37℃作用30 min，250 μl/孔 清洗液洗板3 次，然后每孔加入辣根过氧化物酶标记的驴抗人IgG （上海生工生物有限公司）100 μl在37℃孵育30 min。使用3，3，5，5-四甲基联苯胺底物显色液进行显色15 min，最后加入终止液在450 nm 处测量OD 值。移植后Nabs（Nabs+）的产生被定义为移植后血清对MDA 的血清反应性较移植前增加至少25%［9］。

1.3 Luminex 技术检测抗HLA 抗体和抗供者特异性抗体：利用Luminex 液相芯片系统，采用LIFECODES LifeScreen Deluxe®PRA 和LIFE CODES LSA®Single Antigen（美国Immucor 公司）检测肾移植术前和术后抗HLA 抗体和抗供者特异性抗体的水平。按照试剂盒操作说明书，应用Luminex 读取检测结果，MATCH IT Antibody 软件进行分析。

1.4 AMR 的 诊 断：AMR 判 断 依 据Banff 2013 标准和中国肾移植排斥反应临床诊断与治疗指南 （2016 版）的临床和病理结果［10］。肾脏组织学评价指标包括：肾小球炎（g）、血管内膜炎（v）、间质炎症细胞浸润（i）、小管炎（t）、管周毛细血管焱（ptc）、小动脉玻璃样变（ahh）、动脉内膜纤维化（cv）、间质纤维化（ci）以及小管萎缩（ct）。

1.5 统计学分析：应用SPSS 20.0 版软件进行统计学处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以率表示。组间正态分布的计量资料采用t 检验，组间计数资料均采用卡方检验，影响受者存活时间的单因素分析采用Kaplan-Meier 回归模型，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

1.6 伦理学：本研究符合医学伦理学标准：得到伦理委员会审批（审批号：2019N164KY）。

2 结 果

2.1 肾移植术后患者一般资料分析（表1）：两组肾脏移植受者在性别、年龄、术前并发症、HLA错配数、DSA 产生情况、免疫抑制剂方案等方面的差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

表1 肾移植受者一般临床资料

2.2 Nabs+组与Nabs-组移植肾存活率的比较 （图1）：随访期间共有5 例肾移植受者出现移植肾功能丧失，其中Nabs+组3 例，Nabs-组2 例。Nabs+组移植术后移植物存活率明显低于Nabs-组，差异有统计学意义（P=0.044）。

图1 Nabs+组与Nabs-组移植肾存活率比较

2.3 Nabs 抗体与移植病理结果的比较：移植术后Nabs+的患者在肾小球炎症（g）、间质淋巴单核细胞侵润（i）、肾小管炎（t）和C4d 沉积的平均Banff评分都显著升高，其中间质淋巴单核细胞侵润（i）有显著性差异（P=0.047，图2D）。管周毛细管（ptc）（P=0.23，图2B）、肾小球炎症（g）（P=0.24，图2C）、肾小管炎（t）（P=0.84，图2E）和C4d沉积（P=0.59，图2A）两组间比较无显著性差异。

2.4 两组Nabs 与移植肾功能的关系：Nabs+组eGFR的均值为（19.0±4.0） ml/（min·1.73 m2）, Nabs- 组估算肾小球过滤率（estimated glomerular filtration rate，eGFR） 的 均 值 为（21.7±2.5） ml/（min·1.73 m2）， eGFR 测定的肾功能在Nabs+ 患者与Nab- 患者相比有所下降，但差异无显著性 （P=0.64， 图3）。

图3 Nabs+组和Nabs-组eGFR 值的比较

3 讨 论

在实体器官移植AMR 中，非HLA 抗体的作用日益被认识到。以往的研究，Nabs 是与肾脏和心脏移植的不良结果相关的非HLA 抗体［11-12］。移植环境中自身抗体的产生取决于多种因素，通过缺血/再灌注、同种异体免疫和慢性炎症介导的移植物损伤可导致凋亡细胞表面表达细胞内蛋白，提高了这些细胞作为自身抗原的可能性。随后，在细胞外小泡或第三级淋巴组织中，自身抗原可由受体或供体抗原提呈细胞呈递给自身反应性T 细胞和B 细胞，更好地理解自身抗体产生的机制可能导致识别新的治疗策略，以预防或控制移植排斥反应和异常血管重塑。目前对在移植过程中引发免疫反应的自身抗原的不完全了解，从而阻碍了AMR 的诊断和治疗。本研究探讨了Nabs的发生与移植后的长期结果和移植物损伤之间的关系，Nabs+组移植术后移植物存活率明显低于Nabs-组。本研究与See 等［9］报道的结果相 一致。

由于入组的肾移植患者均发生了排斥反应，本文进一步研究了Nabs 与移植肾穿刺活检和Banff评分之间的关系，结果显示移植术后Nabs+的患者在肾小球炎症（g）、间质淋巴单核细胞侵润（i）、肾小管炎（t）和C4d 沉积的平均Banff 评分都显著升高，其中间质淋巴单核细胞侵润（i）有显著性差异。

Nabs 的产生机制及其作用方式仍不明确。有研究报道，供体特异性抗体（donor specific antibody，DSA）介导的移植物损伤暴露内皮细胞新表位，导致产生针对移植物的自身抗体［13］。然而，本文的研究结果表明，在没有DSA 的情况下，Nabs 可以产生。此外，对小鼠的研究表明，缺 血/再灌注损伤暴露了导致组织破坏的隐蔽自身抗原［14］。人类移植肾的这种早期损伤可能会刺激内皮脂质过氧化，导致氧化特异性表位暴露和Nabs的产生。手术创伤引起的局部炎症和移植物组织损伤，残留的T 细胞同种异体反应，甚至某些免疫抑制剂的肾毒性也可能触发Nabs 的产生。此外，已知氧化特异性表位与细菌抗原（如肺炎链球菌的抗原)发生交叉反应［15］。因此，接触细菌也可能是Nabs 产生的潜在机制。

据文献报道，HLA 和非HLA 抗体都通过补体非依赖性的方式引起移植物损伤，包括抗体依赖的细胞毒性和内皮细胞的激活［16-17］，Nabs 也可能以类似的方式激活移植物内皮。已有报道研究，DSA 和AT1R 抗体这两种抗体可能存在生物协同作用［18-19］。但由于本研究样本量较少，没有涉及Nabs 和DSA 之间的相加效应，但在这两种抗体的患者中观察到的移植物存活率是显著降 低的。

总体而言，本研究对发生排斥反应的肾移植受者进行的回顾性研究强调了Nabs 作为移植物丢失的独立免疫危险因素的相关性。Nabs 与移植后年组织损伤的组织学标志物之间的关系也表明它们参与导致长期移植失败的移植物退化过程。下一步我们会增加样本量作进一步深入研究，从而指导临床疾病状态的分析及进一步的免疫抑制治疗，并制定策略，以改善长期移植结果。