一株羊源无乳链球菌分离鉴定

孟卫芹 陈金龙 姚春阳 王金良*

（1，山东省滨州畜牧兽医研究院 256600；2，山东绿都生物科技有限公司 256600）

乳腺炎是奶山羊的常见病和多发病，会导致奶产量及品质的下降，给奶山羊养殖业造成巨大的经济损失，并给人类公共卫生安全带来巨大隐患，山东省约1/4 的奶山羊患有乳腺炎，其中大部分为隐性乳腺炎，病原微生物感染及不合理的饲养管理是引起该病的主要病因[1]。引起羊乳房炎的病原微生物众多，据报道有80 多种[2]，金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、大肠杆菌及无乳链球菌是引起该病的主要病原菌[3,4]，其中无乳链球菌属B 群链球菌，为重要的人畜共患致病菌之一，可导致婴幼儿脑炎、败血症、肺炎、红斑狼疮等严重疾病[5]。笔者用传统微生物学分离鉴定和药敏试验对该羊场中患病乳腺炎的山羊奶样进行细菌分离鉴定，并对分离鉴定出的无乳链球菌进行耐药性分析，旨在为该羊场无乳链球菌性乳房炎性的治疗提供检测数据的支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山东省某羊场的疑似无乳链球菌性乳腺炎患病羊所产羊奶。

1.1.2 试剂

胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）为OXOID 公司产品；革兰氏染色液购自广东环凯微生物科技有限公司；萘啶酸、多黏菌素、结晶紫购自上海华蓝科技有限公司，细菌DNA 提取试剂盒及Taq DNA 聚合酶预混液购自北京百泰克生物科技有限公司，细菌微量发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；链球菌选择性TSA 固体培养基经116℃高压20 min，冷却到45℃左右后加入无菌结晶紫0.2ug/ml、萘啶酸20ug/ml、多黏菌素3ug/ml 及5%的牛血清，普通琼脂绵羊血平板按常规方法制备，4℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 奶样的采集

采样前先用温水洗净乳房并对其进行消毒处理，消毒后前期采集的乳汁弃掉，尽量无菌采样，每个乳区收集5～10ml 于无菌样品袋中，做好标记，奶样收集完成置于冷藏并立即送往实验室进行细菌分离培养。

1.2.2 细菌的分离

超净台内用无菌接种环蘸取奶样后划线接种于选择性TSA平板，于37℃培养24h 后观察细菌的分离情况，并对分离菌进行革兰氏染色、镜检，对疑似菌落接种普通琼脂绵羊血平板观察有无溶血现象。

1.2.3 生化试验

将分离菌株分别接种于5%乳糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等糖发酵试验，同时马尿酸钠水解试验、七叶苷水解试验、过氧化氢酶试验等，37℃培养24h，观察生化反应特性并记录试验结果。

1.2.4 无乳链球菌的PCR 鉴定

1.2.4.1 模版的制备

取细菌培养物1.5ml，使用DNA 提取试剂盒提取基因组DNA 存于-20℃保存备用。

1.2.4.2 无乳链球菌的PCR 鉴定引物

根据Radhan[6]等人设计的乳腺炎无乳链球菌鉴定引物ST-F:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′ P1:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′；P2:5′-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTAGAA-3′，预期扩增片段大小为162bp，并由安徽通用生物有限公司合成。扩增片段直接送安徽通用生物有限公司测序。

1.2.5 无乳链球菌药敏试验

将分离株细菌培养物稀释后均匀涂布于含5%血清的TSA平板，选取相应抗生素的药敏纸片贴于平板上，37℃培养24h后观察并判定结果。

2 结果

2.1 细菌的分离

如图1 可知，37℃培养24h 后在选择性TSA 平板上形成圆形、灰白色、表面光滑湿润、微凸、边缘整齐的菌落。革兰氏染色为阳性球菌，成对或短链状存在。在普通琼脂绵羊血平板上有溶血现象。

2.2 生化试验

生化试验表明，该分离菌发酵5%的乳糖、海藻糖，不发酵棉糖、菊糖、山梨醇、甘露醇，马尿酸钠水解试验为阳性，七叶苷水解试验为阴性，过氧化氢酶试验为阴性，CAMP 试验为阳性。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》该分离菌为无乳链球菌。

2.3 无乳链球菌的PCR 鉴定

PCR 鉴定结果显示在162bp 位置出现目的条带（图2），测序结果与NCBI 上公布的无乳链球菌序列同源性在99.8%以上。

2.4 药敏试验

药敏试验表明分离株对氟苯尼考、头孢噻夫、恩诺沙星敏感，而对环丙沙星、磷霉素、阿莫西林、庆大霉素、硫酸卡那霉素、新霉素、多西环素耐药。

3 讨论

山羊乳腺炎多数为隐性乳房炎，无明显的临床症状或病理变化轻微，但在气温骤降、饲养管理不善等应激条件下会转变为临床型乳腺炎，危害严重，目前隐性乳腺炎的治疗主要以抗生素治疗为主。虽然抗生素在临床上发挥了巨大的作用，但在治疗中滥用抗生素的情况日益严重，导致抗生素残留和耐药菌株的出现，使得治疗效果下降，不仅增加治疗成本，而且会导致奶制品品质下降。本试验分离临床无乳链球菌时，在培养基中添加萘啶酸、多黏菌素和结晶紫，其中萘啶酸和多粘菌素B对大肠杆菌、变形杆菌、嗜血杆菌等革兰氏阴性菌具有抑菌或杀菌作用，结晶紫可以抑制乳样中金黄色葡萄球菌的生长，大大提高无乳链球菌的分离效率。乳腺炎致病菌的分离鉴定及药敏试验可以筛选出有效的治疗药物，这对兽医临床上治疗羊乳腺炎具有重要的指导作用。