山羊粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因克隆

王楠 刘明国 万双秀 李金芮 李翌 姜勋昊 姜莉莉*

（1，菏泽学院药学院 274015；2，山东省郓城诚信医院 274700）

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 是机体重要的免疫调节因子，能促进造血前体细胞的存活和分化[1,2]。GCSF可刺激特定骨髓前体细胞增殖、分化成粒细胞，刺激多能干细胞的增殖和分化，诱导单核细胞和巨噬细胞的形成[3,4]。作为免疫刺激剂，GM-CSF 可直接作用于免疫细胞，具有较强的免疫增强效果[5,6]。GM-CSF 作为一种理想的免疫佐剂，能增强肿瘤疫苗的免疫效果。GM-CSF 对动物机体的抗感染免疫过程具有高效调节作用，能有效增强机体对疾病的免疫抵抗力，抑制肿瘤恶化、炎症、自身免疫性疾病的作用。GM-CSF 还参与了卵泡发育和排卵等生理过程[7]，研究表明，GM-CSF 在PI3K/AKT通路中也发挥重要作用[8,9]。本研究克隆山羊GM-CSF 基因，并对其进行序列和生物信息学分析预测，为进一步研究GMCSF 的功能及抗病毒的分子机制提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RNAsimple 总RNA 提取试剂盒、FastKing cDNA 合成试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA 聚合酶、D2000 DNA Marker、DNA回收试剂盒、DH5α 感受态、pGM-T 载体，T4 DNA 连接酶，均购自TIANGEN 公司；LB 培养基，购自Solarbio 公司；PCR仪、全自动数码凝胶成像仪、台式高速冷冻离心机。

1.2 引物设计

参考Genbank 中已发表的山羊CM-GSF 基因序列（登录号：X_53561.1），设计GM-CSF 基因RT-PCR 扩增引物F/R，F：5’-ATGTGGCTGCAGAACCTGCTTC-3’；R：5’-CACTTCTGGACTGGTTCCCAG-3’，引物由华大基因生物科技有限公司合成。

1.3 PCR 扩增CM-GSF 基因

Trizol 法提取山羊脾脏组织RNA 并反转录成cDNA。以提取的cDNA 为模板，用引物F/R 扩增CM-GSF 基因。PCR 反应体系50μl:2×Taq PCR MasterMix 25μl，cDNA 模板1μl，上下游引物各2μl，ddH2O 20μl。PCR 反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共3077 个循环；72℃延伸10min，PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收产物送华大基因公司进行序列测定。

1.4 CM-GSF 编码氨基酸序列理化特性分析

使用在线工具ProtParam 分析CM-GSF 编码氨基酸理化特性。

2 试验结果

2.1 GM-CSF 基因PCR 扩增

PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，如附图所示，扩增基因片段在500bp 左右，与预期结果一致。

2.2 GM-CSF 基因核苷酸序列分析

用DNA Star 软件分析印度黑羚GM-CSF 基因的核苷酸序列，结果表明，GM-CSF 基因的CDs 区全长435bp，其中胞嘧啶（C）在四种碱基中含量最高。A（23.3%）、C（31.1%）、G（24.2%）、T（21.4%），且（G+C）%为55.3%，高于（A+T）%，说明GM-CSF 编码区的DNA 双链较稳定。

2.3 GM-CSF 基因编码氨基酸序列理化特性分析

使用在线工具ProtParam 对GM-CSF 的编码氨基酸序列分析，结果表明印度黑羚的GM-CSF 蛋白分子化学式为C727H1141N187O217S10，理论等电点为5.76。在编码的144个氨基酸中含量最多氨基酸是Leu (L)，占比11.8%，含量最低的是Tyr（Y），占比1.4%。编码蛋白的不稳定系数为47.27，推测，该蛋白为不稳定蛋白。在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30h，脂肪系数为81.87，蛋白质的疏水性预测为-0.160。

3 讨论

GM-CSF 是一种具有种属特异性且极具开发潜力的造血生长因子。近年来，因其对免疫系统具有多项调节功能，已被研发成为免疫佐剂或抗肿瘤治疗药广泛在临床实践中应用，多项临床实践反馈的结果也已证实其是一种低毒且高效的免疫佐剂，具有提高疫苗免疫原性的作用。因GM-CSF 可由多种免疫细胞（巨噬细胞、巨细胞、纤维细胞、T 细胞、内皮细胞等）分泌，故可通过诱导小细胞癌分化的途径来抑制肿瘤的恶化，有效降低免疫激活因子和炎性细胞因子活性，进而调节免疫反应，故又被称之为分化诱导器[10]。GM-CSF 基因也可通过刺激树突状细胞和B 细胞等来分泌细胞因子，并与所生成的细胞因子产生协同作用，以达到增强免疫效用的功能[11]。本研究成功扩增山羊GM-CSF 基因，研究成果对深入研究山羊GM-CSF 基因及其功能具有重要意义，为高效、安全免疫佐剂的研发奠定基础。