火针膝周密刺对膝关节骨性关节炎鼠关节形态及软骨LOXL2的影响

2020-10-21李涛任景李俐依

世界中医药 2020年8期

李涛任景李俐依

摘要目的：探讨火针膝周密刺对膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）大鼠行为学、关节形态及软骨中赖氨酰氧化酶相关蛋白2（LOXL2）影响性。方法：选择30只健康雄性大鼠，10只作为对照不作任何处理。20只大鼠建立KOA模型，成模后随机分成2组，分别予普通针刺和火针膝周密刺，1次/3 d，连续6次。观察各组大鼠Leauesne MG评分、关节软骨细胞情况，外周血及关节软骨转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、LOXL2水平变化。结果：治疗后火针组Leauesne MG评分中的局部疼痛刺激反应、步态、关节活动范围、关节肿胀度较对照组、模型组差异有统计学意义（P<0.05）。血清及关节软骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α含量水平显著低于模型组（P<0.05），LOXL2显著高于模型组（P<0.05）。火针组电镜下软骨细胞形状规则、细胞核完整且饱满，微绒毛少量存在，内质网丰富，有散在的染色质。结论：火针膝周密刺能减轻K0A关节软骨损伤，降低炎性反應，改善软骨LOXL2水平，这可能是火针治疗KOA一个作用机制。

关键词火针膝周密刺;膝关节骨性关节炎;大鼠;行为学;关节形态;软骨细胞;赖氨酰氧化酶相关蛋白2

Effect of Around knee Fire Needling on Joint Morphology and LOXL2 in Cartilage of Rats with Knee Osteoarthritis

LI Tao， REN Jing， LI Liyi

（Department of Acupuncture， Urumqi Chinese Medicine Hospital， Urumqi 830000， China）

Abstract Objective：To investigate the effect of fire needle acupuncture around the knee on behavior， joint morphology and lysyl oxidase related protein 2 （LOXL2） in cartilage of rats with knee osteoarthritis （Knee osteoarthritis，KOA）.Methods：30 healthy male rats were selected and 10 rats were used as control without any treatment.KOA model was established in 20 rats.After the model was established， the rats were randomly divided into two groups.They were treated with common acupuncture and around knee fire needling respectively， once every 3 days for 6 consecutive times.The Leauesne MG score， articular chondrocytes and the levels of transforming growth factor-β 1 （TGF-β 1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， matrix metalloproteinase-3 （MMP-3） and LOXL2 in peripheral blood and articular cartilage were observed.Results：After treatment， the local pain stimulation response， gait， joint range of motion and joint swelling of the Leauesne MG scoring in the fire needling group were significantly different from those in the control group and the model group （P<0.05）.The levels of MMP-3， TGF-β 1 and TNF-α in serum and articular cartilage in the fire needling group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）， while LOXL2 was significantly higher than that in the model group（P<0.05）.Under electron microscope， the chondrocytes in the fire needling group had regular shape， complete and full nucleus， a small amount of microvilli， abundant endoplasmic reticulum and scattered chromatin.Conclusion：Fire needling around the knee can reduce the injury of K0A articular cartilage， reduce the inflammatory reaction and improve the level of cartilage LOXL2， which may be one of the mechanisms of fire needling in the treatment of KOA.

Keywords Around knee fire needling; Knee osteoarthritis; Rats; Behavior; Joint morphology; Chondrocyte; Lysyl oxidase-related protein 2

中图分类号：R245 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.007

膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是临床上常见慢性退行性疾病，临床病理改变以关节软骨管进行性变性、破坏，且呈骨质增生反应为主，临床症状常表现为：关节肿胀、疼痛、活动障碍等。随着我国老龄化程度的加深，KOA患者呈不断上升之势，严重影响患者及其家属的生命质量，增加家庭经济负担及国家医疗支出。如何防治KOA成为骨科医师所面临的重要课题之一。本病防治的关键在于避免或者延缓或者逆转软骨细胞变性、凋亡过程。中医将膝骨关节炎划为痹证范畴，八纲辨证认为风、寒、湿是导致经络阻滞不通而发病[1]。針刺作为中医治疗重要组成部分，具有疏通经络气血、消肿止痛功效，疗效显著。火针是针灸一种集经络、穴位、针法、灸法为一体的复合性治疗方法，具有温经散寒、消肿止痛、舒筋通络，能显著改善KOA临床症状。从现代医学上看，火针可调节大脑皮质、植物神经系统、内分泌系统等，通过增强机体细胞和体液免疫以促进代谢和细胞修复。火针直接对病灶和反射点进行刺激，达到改善局部组织水肿、充血、钙化等病理促进局部组织循环，消除临床症状、修复受损组织神经而激发自身对坏死组织吸收，松解粘连组织，促进血液循环[2-3]。本研究模拟人体局部进展过程，以关节制动法制作大鼠膝骨关节炎，模型，使用火针膝周密刺进行治疗，从行为学、关节形态、软骨细胞含量测定等方面整体评估火针治疗的临床疗效，探讨其可能的作用机制，为临床治疗方案的选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

30只健康雄性大鼠，体质量平均为（245±21）g，均为SPF级，由上海交通大学动物实验中心提供（许可证为SCKX（沪）2017-002），饲养环境：温度（23±1.5）℃，湿度（50±1）%，12 h/12 h昼夜交替，试验期间处理流程严格按照《关于善待动物试验的指导性意见》进行。所有试剂盒均购自上海尚海科技有限公司，火针采用北京针灸研究所所制，石膏绷带购自杭州依诺医疗卫生用品有限公司，相关检测仪器为本院实验室自有设备设施。

1.1.2 试剂与仪器

血清转化生长因子-β1（TGF-β1）ELISA试剂盒（上海齐一生物科技有限公司，货号：QY-R2746）;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（艾美捷科技有限公司，货号：K1052-100）;基质金属蛋白酶3（MMP-3）ELISA试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，货号：293323）;赖氨酰氧化酶相关蛋白2（LOXL2）（上海谷研实业有限公司，货号：788323），戊二醛（德州格利洁消毒制品有限公司，批号：283932）。恒温培养箱（杭州硕联仪器有限公司，ZLC-50型）

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 10只健康雄性大鼠作为对照不作任何处理。20只健康雄性大鼠建立KOA模型。建模方法：大鼠禁食12 h后造模，局麻下沿着大鼠后肢髋关节刮除鼠毛至脚趾处，将大鼠踝关节呈背屈70°～90°并用纱布绑紧固定，将膝关节背展呈160°～180°并用纱布绑紧固定，石膏沿着大鼠腹股沟缠绕至后肢，露出脚趾并采用绷带固定，6周后拆除绷带。造模期间每日早晚2次对大鼠进行观察，确保大鼠制动良好，捆绑处无瘀血。造模时间完成后对大鼠的行为学、后肢肿胀、局部压痛程度等进行观察。确认造模成功后，再随机将模型大鼠平均分成2组，分别为模型组和火针针。

1.2.2 干预方法对照组大鼠和模型组大鼠予以正常饲喂、观察。火针组大鼠则每3 d行火针针刺治疗1次。分别于治疗前在大鼠的膝前穴、阿是穴、阳陵泉穴涂抹万花油，采用0.45 mm×0.45 mm号贺氏火针，将火针在酒精外焰烧至红白，对上述穴位分别进行点刺，点刺深度以2 mm为宜，每个穴位点刺3～4次为宜，点刺后快速拔除火针即刻用干棉球按压针孔2～3 s，火针组大鼠共行火针针刺6次。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Leauesne MG评分由同一位经过培训的医师参照MG评分量表对大鼠造模成功后、完成火针治疗后行MG评分，评分分4个项目，分别为局部疼痛刺激反应、步态、关节活动范围、关节肿胀度。上述4个维度均采用likter4级评分法对其严重程度分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级，分级越高说明症状越严重[4-5]。

1.2.3.2 标本采集大鼠行脱颈处死，采集腹主动脉血液离心得上层血清，液氮冻存后置-80 ℃冰箱保存。将大鼠固定，膝关节充分伸展，剜出膝关节，用0.9%的氯化钠溶液冲洗软骨平面，置于4%中性甲醛中保存。

1.2.3.3 血清学检测取血清标本，采用酶联免疫吸附法检测血清转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）变化并比较。

1.2.3.4 软骨组织检测取膝关节软骨组织，称重后用以1∶9软骨组织：生理盐水比率进行混匀，在]4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，取上层清液，按放射免疫法检测软骨组织MMP-3、TGF-β1、TNF-α、赖氨酰氧化酶相关蛋白2（LOXL2）含量水平。

1.2.3.5 电镜下大鼠形态学观察将取膜下来的膝关节软骨制作成1.5 mm×1.5 mm，用2.5%戊二醛固定，采用浓度15%的依地酸二钠溶液脱钙3周，行常规电镜切片，对软骨细胞的形态、胶原纤维排列状况等与电镜下观察。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以]P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠行为学比较试验前对照组和其他2组比较差异有统计学意义（P<0.05），模型组和火针组两两比较差异无统计学意义（P>0.05），火针组大鼠治疗后局部疼痛刺激反应、步态、关节活动范围、关节肿胀度Ⅰ度、Ⅱ度比率显著高于模型组（]P<0.05），对照组和模型组、火针组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 3组电镜下软骨组织所示比较对照组大鼠软骨细胞形态规则，绒毛较多，胞质内粗面内质网少量，细胞核完整，染色质均匀分布，见图1a;胶原纤维粗细不等，排列整齐，可见周期横纹，见图2a。模型组软骨细胞不规则，表面微绒毛消失，细胞内结构消失，有大量空泡，细胞核破裂，染色质浓聚，见图1b;胶原纤维断裂、溶解，横纹消失，见图2b。火针组治疗6周后电镜下示细胞形状规则、细胞核完整且饱满，微绒毛少量存在，胞质具有较为丰富的内质网，有散在的染色质，见图1c;胶原纤维粗细不均匀，排列紊乱，有部分坏死纤维，见图2c。

2.3 3组血清学指标比较

对照组、模型组试验前、试验6周后MMP-3、TGF-β1、TNF-α比较差异无统计学意义（P>0.05），模型组、火针组试验前在MMP-3、TGF-β1、TNF-α上较对照组均显著升高（]P<0.05），治疗6周后火针组MMP-3、TGF-β1、TNF-α较试验前均显著下降（P<0.05），且火针组显著低于模型组（P<0.05）。见表2。

2.4 3组软骨组织指标比较

对照组、模型组试验前、试验6周后软骨组织MMP-3、TGF-β1、TNF-α、LOXL2比较差异无统计学意义（P>0.05），模型组、火针组试验前在MMP-3、TGF-β1、TNF-α上较对照组均显著升高，LOXL2均显著下降（P<0.05），治疗6周后火针组MMP-3、TGF-β1、TNF-α较试验前均显著下降，LOXL2则显著升高（P<0.05），火针组显著优于模型组（P<0.05）。见表3。

3 讨论

KOA是一种常见的关节退行性疾病，患者关节肿胀疼痛，活动障碍，是严重影响患者日常生活及工作的疾病。近些年随着老龄化社会加剧，KOA发病率呈逐年升高趋势。临床研究证实，膝盖软骨所具有的合成降解因子的能力下降，以及反复炎性反应是导致KOA发生的重要原因之一。中医将KOA归属为“骨痹”“膝痹”范畴，因年老体衰、筋骨失养，气血失调，或跌打损伤，瘀血闭阻经脉，或寒湿之邪流注关节，促使气血瘀闭发为此病。针灸作为中医学重要的疾病治疗手段，其在临床关节疾病的治疗中发挥重要作用。其具有疏通经络气血、消肿止痛的功效。《针灸聚英》曰“凡症块结积之病，甚宜火针”。可见火针可温经通脉，振奋正气。火针可将热量用穴位来传导。借助外来火鼓动内生火，振奋阳气，达到祛风散寒、除湿祛痹作用[6-7]。火针膝周密刺法则密集性用火针对病灶区域进行针刺，用足够热量改變局部气血，促进新陈代谢。遵循“快、准、红”原则，当针尖直达骨面后迅速出针，快速提插刺激骨膜产生针感密集针刺[8]。在本次穴位选择上，阳陵泉穴作为筋病治疗的要穴，通过火针点刺发挥强健腰膝、壮筋补虚的功效;膝前穴位和阿是穴是膝关节经络汇聚质地，通过点刺发挥疏通局部经气，能行气活血通络的功效。而火针针刺以上穴位有双重作用，能发挥针刺本身作用，又有火针刺激皮肤产生直接灸作用[9]。火针是针和灸的完美双重结合，有针、热双重性，通过热量传导能温经通脉、振奋阳气，达到祛寒除湿、通经止痛功效[10]。

报道称，火针通过热量传导可使KOA大鼠的毛细血管再一次范围内扩张，达到促进微循环，提升大循环及淋巴循环的目的，促进炎性物质的转移和排泄，达到加强止痛功效[11-12];研究通过对火针进行红外热像图发现，针刺能促使局部血液循环增快，血流状态好转[13]。研究发现，火针能提高病灶区域酶活性，升高镁、锌含量，即改善新陈代谢，增强机体活力，促进充血水肿、粘连瘢痕组织松软，针刺时高温能破坏局部坏死组织，激发机体自身对物质]吸收[14-15]。

MMP-3是MMPs家族成员之一，在KOA关节炎、心血管疾病中发挥重要作用。MMP-3通过刺激软骨细胞外基质蛋白分解酶，可促进软骨代谢，加重膝关节损伤其能[16]。TGF-β1也具有加速细胞外基质蛋白质降解的作用，还对单核细胞和成纤维细胞具有驱化作用而促进成骨细胞和成纤维细胞生长，该指标和骨性关节炎息息相关，是病情加重的重要促进因素[17]。TNF-α对软骨细胞有较强的分解能力，抑制软骨基质合成。有报道称，TNF-α可合成E2，而前列腺E2能分解软骨，诱导激活MMPs，对软骨基质纤维结构造成严重阻碍性[18]。LOXL2属于LOXL家族，其能催化胶原和弹性蛋白中赖氨酰氧化脱氨，能缩合反应形成分子内和分子间交叉连接，这种连接将胶原和弹性蛋白可溶性单体转变为胞质中高度稳定的不溶性纤维，增加胶原和弹性纤维机械强度，能抵抗蛋白酶水解作用[19-20]。

结果显示，KOA模型建立后电镜下可见软骨细胞排列紊乱，软骨表面粗糙，行为学上表现为疼痛、关节肿胀、活动受限。而火针膝周密刺治疗KOA能改善大鼠行为学，缓解局部压痛，减轻肿胀，改善关节活动度和步态，可在很大程度上改善软骨排列情况，改善软骨表面光滑度，缓解疼痛，从而达到治疗目的。而从火针治疗后MMP-3、TGF-β1、TNF-α较建模时的含量显著下降，LOXL2则显著升高，结合各指标的临床意义，可能火针通过抑制KOA大鼠膝周炎性反应，从而保护软骨组织细胞有关，重新恢复胶原细胞纤维活性有关。但本次研究对各个指标之间关联性未明确，这有待进一步探讨。

参考文献

[1]陈婷婷，高楠.膝骨性关节炎的针灸疗法及其作用机制研究进展[J].湖南中医杂志，2019，35（7）：168-171.

[2]封秀梅，郑倩华，罗亚男，等.针灸治疗膝骨性关节炎的临床研究进展[J].湖南中医杂志，2019，35（7）：165-167.

[3]林红菊.温和灸联合电针治疗膝骨关节炎的临床观察及实验研究[D].恩施：湖北民族大学，2019.

[4]刘君伟.温针灸联合骨髓间充质干细胞移植对兔膝骨关节炎软骨组织影响的研究[D].银川：宁夏医科大学，2019.

[5]花儿.火针治疗膝关节骨性关节炎的临床效果分析[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（91）：158.

[6]王立兴.火针结合电针治疗膝关节骨性关节炎的临床研究[D].广州：广州中医药大学，2016.

[7]程刚，吴朔.火针“膝五针”治疗膝骨关节炎38例疗效观察[J].深圳中西医结合杂志，2018，28（15）：68-69.

[8]王琛琛，闻霞.火针配合刺络放血治疗膝关节骨性关节炎的临床疗效研究[J].中国疗养医学，2018，27（6）：582-583.

[9]宋寒冰，于英君，姜益常，等.针刀松解术对膝骨性关节炎软骨细胞作用分子机制实验研究[J].中医药学报，2017，45（5）：64-67.

[10]张卫东，王丕敏，韩润霞，等.火针治疗类风湿关节炎大鼠疗效及安全性评价[J].中国针灸，2013，33（4）：334-338.

[11]吕计宝，赵玉峰，冯玉雄，等.火针结合拔罐治疗风寒湿痹型膝骨关节炎的临床效果[J].广西医学，2017，39（7）：1077-1079.