参麻益智方对多发脑梗血管性痴呆大鼠认知功能和脑白质损伤的影响

李泽惠 曹宇 刘佳妮 刘美霞 裴卉 李浩

摘要 目的：研究参麻益智方对血管性痴呆（VD）模型大鼠认知功能和脑白质损伤的影响。方法：将60只Wistar大鼠经造模手术后随机分为假手术组、模型组、参麻益智方低剂量组、参麻益智方中剂量组、参麻益智方高剂量组和多奈哌齐组。给药2周后行水迷宫实验检测大鼠的认知功能，脑组织LFB染色观察胼胝体髓鞘脱失情况并进行脑白质损伤评分，]Western blot法检测MBP蛋白表达。结果：参麻益智方高剂量组大鼠水迷宫逃避潜伏期明显缩短，目标象限停留时间明显延长，脑白质损伤评分明显降低，MBP表达水平明显升高。结论：参麻益智方可以改善VD大鼠的认知功能，减轻VD大鼠的脑白质损伤。

关键词  血管性痴呆;多发脑梗;参麻益智方;脑白质;髓鞘

Effect of Shenmayizhi Decoction on Cognitive Function and White Matter Damage in Multiple Cerebral Infarction VD Rats

LI Zehui， CAO Yu， LIU Jiani， LIU Meixia， PEI Hui， LI Hao

（Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）

Abstract Objective：To study the effect of Shenma Yizhi Decoction （SMYZD） on cognitive function and white matter lesions in VD rats.Methods：A total of 60 surgery modeled Wistar rats were randomly divided into Sham group， Model group， SMYZD-L group， SMYZD-M group， SMYZD-H group and Donepezil group.After 2 weeks administration of SMYZD， Morris water maze test was used to detect cognitive function of rats.Brain tissue LFB staining was used to observe loss of myelin sheath of the Corpus callosum and White matter damage scoring.Western blot was used to detect the expression of myelin basic protein （MBP）.Results：Escape latency of rats in SMYZD-H group significantly shortened.Time spent in target quadrant significantly prolonged.Grading score of white matter damage significantly diminished， and MBP expression augmented.Conclusion：Shenma Yizhi Decoction could improve cognitive dysfunction and alleviate white matter damage of VD rats.

Keywords Vascular dementia; Multiple cerebral infarction; Shenma Yizhi Decoction; White matter; Myelin sheath

中圖分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.006

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是在各种脑血管病和心血管病引起的缺血缺氧性脑组织损害基础上产生的一种严重的认知功能障碍性疾病。其临床表现为社会生活能力、认知、记忆和思维等能力的减退，并伴随情感、人格的改变[1-2]。前期临床研究表明，参麻益智方可以改善VD患者的认知功能障碍，但其作用机制尚不甚明确。脑白质脱髓鞘改变是临床上VD患者常见的影像学表现之一[3-4]，本研究采用多发性脑梗死模型，从脑白质脱髓鞘改变入手，探讨参麻益智方对VD大鼠认知功能和脑白质损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级10周龄体质量（300±20）g的雄性Wistar大鼠60只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于本院的实验动物室，温度（23±2）℃，湿度（50±10）%，人工光照明暗各12 h，自由取用基础饲料]和水。

1.1.2 药物 参麻益智方由人参9 g、天麻9 g、鬼箭羽9 g、川芎6 g组成。实验所用中药水煎浓缩剂由西苑医院制剂室提供，于4 ℃冰箱保存。多奈哌齐（卫材中国药业有限公司，国药准字H20050978）。

1.1.3 试剂与仪器 聚苯乙烯微球（美国Polysciences公司，货号：9003-53-6#684020）;兔抗大鼠MBP多克隆抗体（Proteintech公司，货号：10458-1-AP）;兔抗大鼠beta Actin多克隆抗体（Proteintech公司，货号：20536-1-AP）;HRP标记的山羊抗兔IgG（Proteintech公司，货号：10285-1-AP）;Morris水迷宫系统（北京众实迪创公司，ZS-001型）;超纯水机（美国Millipore公司，Mili-Q型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 对大鼠适应性饲养1周后，参考Moriyama等的方法[5]，行微球注射造模手术，过程简述如下：术前禁食，以2%戊巴比妥钠]40 mg/kg腹腔注射麻醉。仰卧固定，以碘伏消毒颈部，行正中切口约1.5 cm。钝性分离皮下组织和肌肉，暴露出颈总动脉所行的位置。仔细分离右侧颈总动脉，注意不伤及迷走神经，然后继续向上分离颈外动脉。用小号动脉夹小心夹闭颈总动脉，用手术线结扎颈外动脉的远心端。以1 mL注射器从颈外动脉匀速、缓慢地向颈内动脉注入右旋糖酐溶液稀释的聚苯乙烯微球溶液0.2 mL（假手术组注入]0.2 mL右旋糖酐溶液）。拔出注射器，随即将颈外动脉近心端结扎，并松开颈总动脉上的动脉夹。逐层缝合，待苏醒后送回笼。术后24 h对大鼠进行Zea Longa神经功能缺损评分[6]：无神经功能缺失症状计为0分;不能完全伸展对侧前爪计为1分;向外侧转圈即追尾计为2分;向对侧倾倒计为3分;不能自发行走或意识丧失计为4分。选择1～3分的大鼠进行后续的实验。将模型建造成功的大鼠随机分入模型组、参麻益智方低剂量组、参麻益智方中剂量组、参麻益智方高剂量组和多奈哌齐组，每组10只。假手术组每组10只。

1.2.2 给药方法 按大鼠与人体表面积换算方法计算给药量，参麻益智方低剂量组予3.3 g/（kg·d）灌胃，参麻益智方中剂量组予6.6 g/（kg·d）灌胃，参麻益智方高剂量组每天予16.5 g/kg灌胃，多奈哌齐组予0.5 mg/（kg·d）灌胃，假手术组和模型组每天予等量蒸馏水灌胃，共给药14 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 认知功能评价 采用Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力。正式开始实验前1 d，将大鼠放入水中适应性游泳1次。实验前5 d进行定位航行实验，将平台置于第一象限（西南）。将大鼠头朝池壁，随机从东南、南、东、西北4个方位之一放入水中。记录大鼠游泳的路程和时间。以大鼠找到水中平台的时间即逃避潜伏期作为大鼠学习能力的检测指标。在每次训练中，若时间超过90 s，则引导大鼠到平台上停留10 s。每日每只大鼠训练4次，每2次训练间隔15 min。第六日将平台撤除，进行空间探索实验。入水点选择原平台位置的对侧（东北），以大鼠在目标象限（即原平台所在象限）停留时间作为大鼠空间记忆的检测指标。

1.2.3.2 取材 水迷宫实验结束后第2天，以2%的戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉全部大鼠。从每组随机取5只进行灌注固定：仰卧固定，开胸后暴露心脏，用注射器针头由心尖插入左心室，快速灌注4 ℃预冷的PBS溶液约100 mL至肝脏无血色，随后灌注4%多聚甲醛溶液（4 ℃预冷），至尾部和肢体僵直，立即开颅取脑，迅速将大脑浸泡于4%多聚甲醛溶液，24 h后，进行石蜡包埋，5 μm切片备用。其余大鼠麻醉后开腹，经腹主动脉取血，随后立即取脑，将右侧脑组织置于液氮冰冻后放入-80 ℃冰箱保存，待行Western Blot检测。

1.2.3.3 卢卡斯快蓝（Luxol Fast Blue，LFB）染色和脑白质损伤评分 脑组织切片脱蜡后放入0.1%LFB染液，56 ℃孵育过夜，95%乙醇洗掉多余染色液后转入蒸馏水洗，用0.05%碳酸锂和70%乙醇分色至灰白质分辨明显，随后梯度脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察大鼠脑胼胝体区白质损伤情况并进行评分：正常髓鞘形态记为0分;髓鞘紊乱、染色变浅记为1分;髓鞘断裂，明显的空泡形成记为2分;髓鞘不能显示阳性染色记为3分[7]。

1.2.3.4 Western Blot检测 取冻存的大鼠脑组织每只约20 mg，冰上操作，加入0.3 mL含1%PMSF的RIPA裂解液，超声匀浆后，4 ℃，10 000×g离心]5 min。取上清液进行蛋白浓度测定（BCA法）。取蛋白样品经12.5%的SDS-PAGE胶分离，电转法转移到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（1∶2 000稀释），4 ℃过夜，TBST洗涤3次，加入二抗（1∶10 000稀释），室温孵育2 h，TBST洗涤3次，ECL法显影。以β-actin为内参，分析各条带的相对灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0和Graphpad软件对数据进行统计学分析。2组间比较采用独立样本t检验，水迷宫数据的分析采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 认知功能比较 各组大鼠逃避潜伏期呈逐天递减趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05），目标象限停留时间明显缩短（P<0.05），提示多发脑梗大鼠的学习记忆能力受到损害。与模型组比较，参麻益智方高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），目标象限停留时间明显延长（P<0.05），提示参麻益智方能够改善多发脑梗大鼠的认知功能损害。见图1。

2.2 脑白质损伤程度比较 经LFB染色，假手术组胼胝体神经纤维排列整齐、致密，髓鞘呈蓝色;模型组胼胝体神经纤维稀疏弯曲、排列紊乱，有空泡形成，髓鞘着色变浅。与假手术组比较，模型组白质损伤评分明显升高（P<0.05）;与模型组比较，参麻益智方高剂量组脑白质损伤评分明显降低（P<0.05）。见图2。

2.3 各组脑组织髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein，MBP）表达 与假手术组比较，模型组脑组织中MBP的表达水平明显降低（P<0.05）;与模型组比较，多奈哌齐组和参麻益智方高剂量组的MBP表达水平明显升高（P<0.05），参麻益智方低剂量组和中剂量组的MBP表达水平有升高趋势（P>0.05）。見图3。

3 讨论

血管性痴呆属中医学“呆病”“健忘”等范畴，现代医家总结其病变在脑，其发病涉及肾、肝、脾等脏腑，其病机总属本虚标实，以脏腑亏虚、气血不足为本，痰、瘀、浊毒等病理产物蒙蔽脑窍为标。《灵枢》中有“五十岁肝气始衰……七十岁脾气虚，皮肤枯。八十岁肺气衰，魄离，言善误”之言，其中“言善误”乃痴呆的一种表现，推之元气虚衰是导致痴呆的病因之一。《伤寒论》中有“阳明证，其人善忘……本久有瘀血，故令喜忘”，指出健忘可由瘀血造成，其治以抵当汤祛除瘀血。气血不足则脑府失养;肾主骨生髓，肾精不足则脑髓不充;肝肾阴亏，则阳失阴制，亢盛于上，扰乱清空;肝失疏泄则气机不畅，气行则血行，气滞则血瘀;脾虚则水湿失于运化，停滞而成痰浊;血瘀、痰浊进一步蒙蔽脑窍，日久更能酿为浊毒。治疗上多以补虚泻实、标本兼顾为基本治疗原则[8]，主要为补气、活血、补肾阴、平肝阳、祛瘀血、化痰浊等。

参麻益智方是由本院周文泉老教授治疗血管性痴呆的经验方改良而来的，由人参、天麻、鬼箭羽和川芎四味药组成。人参能够大补元气，安神增智。如《本草汇言》称人参能补气生血，助精养神。《神农本草经》言人参能补五脏，开心益智。天麻滋阴潜阳而平肝。《本草汇言》称天麻“主头风，头痛……语言不顺，一切中风，风痰”。鬼箭羽能够破血祛瘀，行血通经。川芎活血行气并引诸药上行于脑。此四药合用，共奏补虚增智，活血平肝之效，用于血管性痴呆之气虚血瘀、肝阳上亢证。团队已用高效液相色谱法对参麻益智方总提取物进行了药物成分测定，结果共检测到包括人参皂苷Rg1、Rb1、Re、天麻素、槲皮素、阿魏酸5种入脑成分的11种主要成分[9]。

Loeb等[10]将VD分为8种类型，主要有多发性梗死所致的痴呆、关键部位梗死所致的痴呆、多发性皮质下腔隙损害所致的痴呆、出血性病灶所致的痴呆和Alzheimer病与VD混合的混合型痴呆等。本研究采用聚苯乙烯微球脑内注射诱导多发性脑梗死模型，可以模拟多发梗死性痴呆这一类型[11]。本研究的行为学实验结果表明模型大鼠具有认知功能的损害，说明此模型作为血管性痴呆的模型建造成功。而参麻益智方干预后可见大鼠的认知功能得到改善，表明參麻益智方对于血管性痴呆具有治疗]作用。

脑白质损伤是血管性痴呆的常见病理表现之一[12-13]。脑白质作为大脑皮质处理信息的补充，有助于大脑的信息传递，使神经系统具有快速高效的整合能力，对于人的认知功能十分重要[14]。而脑白质由于具有较少的侧支循环，较灰质更易受到缺血损害[15]。胼胝体是大脑最大的白质带，较易进行观察和比较，因此本研究选择对胼胝体的观察来进行各组大鼠的脑白质损伤的比较。

脑白质主要由神经元轴突、包饶轴突的髓鞘和胶质细胞组成。其中髓鞘具有支持轴突和绝缘的作用，保证了冲动的传导。脑白质受损可表现为髓鞘的曲折、断裂或完全消失等[16]。卢卡斯快蓝（LFB）是一种可以将髓鞘染为蓝色的染料，可以方便观察髓鞘的结构。我们利用LFB染色观察胼胝体髓鞘的形态和脱失情况，结果显示与假手术组比较，模型组髓鞘染色变浅，神经纤维变得稀疏、杂乱，有髓鞘脱失，说明多发脑梗手术能够造成脑白质的脱髓鞘损伤;而参麻益智方干预后脑白质损伤评分较模型组明显降低，提示参麻益智方对脑白质髓鞘具有保护作用。

髓鞘碱性蛋白MBP是位于髓鞘浆膜面的一种膜蛋白，约占髓鞘蛋白总量的1/3，其含量的高低可以反映脱髓鞘病变的严重程度，是评价脱髓鞘的严重程度和髓鞘再生情况的重要指标[17-18]。我们用Western blot法检测了脑组织MBP的表达在各组间的差异。结果显示，模型组MBP表达较假手术组明显降低，说明多发脑梗模型存在脱髓鞘损伤;参麻益智方干预后MBP的表达明显升高，表明参麻益智方能够改善脑缺血损伤所致的脑白质脱髓鞘改变。

综上所述，聚苯乙烯微球脑内注射诱导的大鼠多发性脑梗死模型可以作为研究脑白质脱髓鞘改变的动物模型。参麻益智方能够改善血管性痴呆模型大鼠的认知功能，其改善认知功能的机制可能是通过对脑白质髓鞘的保护。

参考文献

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[7]Shibata M，Ohtani R，Ihara M，et al.White matter lesions and glial activation in a novel mouse of chronic cerebral hypoperfusion[J].Stroke，2004，35（11）：2598-603.