三七三醇皂苷通过PI3K/Akt通路减轻大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的研究

文超,王子杨,鲁卫星

心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是指心肌在缺血/再灌注的过程中，由于再灌注而引发不可逆损伤的一种现象[1]。I/R损伤的作用机制目前尚未完全明确，抗心肌缺血/再灌注损伤的药物研究和开发目前大多处于实验阶段。

Oscar Langendorff 在1895年最早实现了哺乳动物离体心脏灌流，之后随着这一实验方法的普及与发展，Langendorff离体心脏灌流被广泛应用在心脏缺血/再灌注的病理生理学研究中。该模型具有实验操作方便，费用相对低廉，试剂制备简单，实验因素相对容易控制，稳定性较好，可重复性较强等优点[2-3]，适合用作心脏缺血/再灌注损伤的研究。

三七为五加科植物三七的干燥根,具有散瘀止血，消肿定痛的功效。三七三醇皂苷(panaxatriol saponins,PTS)为较新的三七类药物，其中主要活性成分人参皂苷Rg1的含量达60%以上,Rg1、R1、Re三者的总含量约达80%，在治疗缺血性心脑疾病中具有广泛的生物学功能[4]。

现通过Langendorff离体心脏灌流装置建立大鼠心肌缺血/再灌注模型，研究PTS对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的作用，并探讨其是否通过PI3K/Akt信号通路发挥作用，为PTS在心肌缺血再灌注损伤的临床治疗中提供一定理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：健康雄性Wistar大鼠40只，体质量250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[合格证号：SCXK(京)2016-0006]。主要实验设备：Langendorff(澳大利亚AD Instruments Pty Ltd 实验室，ML870B2)、多导生理仪(美国Biopac MP150)。

1．2 实验方法

1．2．1 模型建立：取大鼠称重，以1×103U/kg腹腔注射肝素，充分肝素化后以1 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉。在大鼠充分麻醉之后，将其置于手术台上固定，开胸，并充分暴露主动脉弓，用镊子夹紧主动脉弓分支前的位置，在主动脉弓以下位置剪断主动脉，剪下完整心脏，迅速放入装有0℃预冷K-H液的平皿中[5]，并去血。提前将蠕动泵流速调为10 ml/min，排净Langendorff装置管内气体，以避免连接时空气进入主动脉。迅速用镊子夹持主动脉管壁，并将灌注管插入主动脉中，用0号线在主动脉和灌注管连接处打结以固定心脏，逆行灌入含有95% O2和5% CO2的37 ℃ K-H液，剪开右心耳，以便灌流液流出，以此状态平衡20 min。待心脏稳定复跳，剪开左心耳，经左心耳破开二尖瓣，将心室内压球囊放入左心室，测试导管通过压力感受器连接多导生理仪，记录全程心脏电生理活动。入组标准：心律齐，心率≥220次/min，左室收缩压≥60 mmHg。后依据分组情况给予不同操作及给药。

1．2．2 分组及给药：应用随机数字表法将40只健康雄性Wistar大鼠随机分为5组，各8只。(1)对照组：只穿线不结扎，以K-H液持续灌流105 min。(2)模型组(I/R)：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处，令左前降支局部停灌30 min，后开放结扎线，K-H液复灌75 min。(3)PTS组(I/R+PTS)：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30 min，以含10 mg/L PTS(由成都华神药业股份有限公司提供)的K-H液复灌75 min。(4)LY294002组(I/R+LY294002)：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30 min，以含15 μmol/L LY294002的K-H液复灌75 min(LY294002为PI3K/Akt信号通路的特异性阻滞剂)。(5)LY294002 +PTS组(I/R+LY+PTS)：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30 min，先以含15 μmol/L LY294002的K-H液复灌 15 min，再以含10 mg/L PTS的K-H液复灌60 min。

1.3 观察指标与方法 (1)通过多导生理仪记录全程心率(HR)、左心室收缩末压(LVESP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP)、左室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)等心功能指标。(2)收集各组平衡灌注20 min、局部停灌30 min、再灌15 min、再灌75 min的灌流液，并测量心肌酶学指标肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)。(3)取左心室梗死边缘区心肌组织行免疫组化分析心肌组织Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况，采用染色强度结合阳性细胞百分比综合计分，组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色为阳性细胞标志。染色强度以多数细胞呈现的染色特性记分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即5个视野阳性心肌细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。每组取3张切片，每张切片随机取3个400倍视野，每个视野计分为染色强度与阳性细胞百分比分数的乘积，结果平均后取整数：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。(4)Western-blot法检测各组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的蛋白表达，并用Image-J软件对结果进行灰度分析[6]。

2 结 果

2.1 各组血流动力学参数比较 通过多导生理仪记录心脏的血流动力学参数，并将各组4个时刻的数据进行比较，并计算与平衡末变化量占比[平衡末变化量占比=(平衡灌注20 min-再灌注75 min)/平衡灌注20 min]×100%，见表1、图1。

HR比较：对照组4时刻无明显变化(P>0.05)，其余各组均不同程度上升，且除对照组外其余4组在再灌注75 min时无明显差异(P>0.05)。LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dt max比较：对照组4时刻无明显变化或少量下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。其余各组随时间延长出现不同程度下降，提示缺血再灌注损伤会造成左心室收缩、舒张功能的下降。再灌注75 min时，PTS组变化量占比明显低于模型组(P<0.05)。而LY+PTS组与模型组无明显差异，与PTS组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组心肌酶学参数比较 CK-MB、LDH组内比较：除对照组外，各组再灌注后心肌酶漏出量均较同组局部缺血30 min有显著提升(P<0.05)。组间比较：各组平衡20 min时心肌酶漏出量比较差异无统计学意义(P>0.05)；局部缺血30 min时，各组CK-MB比较差异无统计学意义(P>0.05)，而LDH各组较对照组有所升高(P<0.05)；再灌注15 min、75 min时，各组均显著高于对照组(P<0.05)，PTS组明显低于I/R组(P<0.05)，LY+PTS组高于PTS组(P<0.05)，见表2。

表1 各组血流动力学参数变化量占比变化比较

表2 各组灌流液中CK-MB和 LDH水平比较

2.3 各组Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表达比较 Western-blot结果显示，经过I/R损伤后，各组心肌组织Akt、GSK-3β表达差异无统计学意义(P>0.05)，LY294002组、LY+PTS组心肌组织p-Akt、p-GSK-3β表达较I/R组显著下降(P<0.05)，PTS组表达较I/R组显著提高(P<0.05)，见图2。

2.4 免疫组化法分析Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达 免疫组化结果显示，I/R组Bax、Caspase-3阳性表达显著高于对照组，PTS组和LY+PTS组Bax、Caspase-3阳性表达较I/R组低。I/R组Bcl-2强阳性表达显著低于对照组，PTS组较I/R组显著提高，LY+PTS组显著低于PTS组(P<0.05)，见图3。

3 讨 论

迄今为止，对于急性心肌梗死最为有效且快速的治疗方式仍是心肌再灌注[7]。然而再灌注带来的损伤目前尚无有效的措施可以减轻或预防[8]。磷酸肌醇—蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是一种广泛存在的信号通路，已经被大量研究证实其参与了多种细胞生理活动。Akt是PI3K下游最重要的中心调节分子之一，p-Akt为磷酸化活化形式，大量研究已经证实，其可以通过调控、激活下游分子，发挥生物学功能，如p-Akt可以调控下游分子GSK-3β的磷酸化，减少Caspase-3的活化，对心肌缺血/再灌注损伤产生保护作用[9-11]；也可以激活Bcl-2，减少Bax的活化，稳定线粒体的内外膜，发挥抗凋亡的作用，从而缓解心肌缺血/再灌注损伤[12]。

注：与I/R组比较，a P<0.05；与PTS组比较，b P<0.05

图3 各组免疫组化染色情况(IHC染色，×400)

PTS作为在心脑血管疾病中拥有广泛生物学功能的药物[4]，是否能够在心肌缺血/再灌注损伤中发挥积极作用证据尚显不足。因此，本实验研究中，采用Langendorff离体心脏灌流装置，构建大鼠心脏缺血/再灌注模型进行研究与探讨。本实验研究结果表明，灌流液中给予10 mg/L的PTS处理，可以显著减轻缺血/再灌注带来的心肌损伤，具体体现在以下2个方面：(1)减少心肌酶的释放。CK-MB和 LDH是心肌细胞中存在的两类心肌酶，在心肌细胞受损时向外释放增加。血清中CK-MB和LDH的升高可以作为衡量心肌缺血/再灌注损伤程度的重要指标。本实验研究结果表明，心肌缺血/再灌注可以引起心肌酶CK-MB和LDH释放增多，而PTS可以有效减少CK-MB和LDH的漏出，减少缺血/再灌注对心肌细胞的损伤。此外，在PI3K/Akt通路特异性阻滞剂LY294002的作用下，PTS减少心肌酶漏出的作用一定程度上下降，与单用PTS组存在统计学差异(P<0.05)，提示PTS可能通过激活PI3K/Akt通路发挥作用。(2)改善左心室功能。在血流动力学参数中，LVESP、LVDP、+dp/dt max可以评价左心室的收缩功能，LVEDP、-dp/dt max可以评价左心室的舒张功能，HR可以评价左心室的心肌耗氧量[13]。本实验研究结果表明，心肌缺血/再灌注可以导致左心室收缩、舒张功能降低，而PTS具有改善左心室收缩、舒张功能的作用，并且在LY294002预处理下该作用显著降低。提示PTS可能通过激活PI3K/Akt通路发挥作用。而除对照组外其余4组在再灌注75 min时HR比较无明显差异(P>0.05)，提示PTS对心肌耗氧量变化无明显效果。

Western-blot法与免疫组化染色结果显示，PTS可能通过PI3K/Akt信号通路增加Akt的磷酸化表达，从而增加GSK-3β的磷酸化，减少Caspase-3的活化；还可以激活Bcl-2，减少Bax的活化，使线粒体内外膜保持稳定，实现抗凋亡的作用，从而缓解心肌缺血/再灌注损伤。

综上所述，PTS可以减轻心肌缺血/再灌注损伤，其作用的实现可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明：

文超：设计研究方案，实施研究过程，进行统计学分析，论文撰写；王子杨：资料搜集整理，实施研究过程，论文撰写，论文修改；鲁卫星：提出研究思路，论文审核