长链非编码RNA⁃肺腺癌转移相关转录因子1对大鼠急性胰腺炎腺泡细胞增殖和凋亡的影响

卫艳平 侯伟 崔抗

1洛阳东方医院重症医学科（河南洛阳471000）；2郑州大学（郑州450000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由于多种因素损伤胰腺细胞，激活胰蛋白酶原等，导致胰酶消化自身胰腺及其周围组织，引起炎症级联反应，严重者可导致全身性炎症反应，病死率和并发症发生率较高［1-3］。长链非编码RNA（long noncod⁃ing RNA，LncRNA）参与调控胰腺癌细胞的增殖和侵袭过程［4］。动物实验显示，AP 大鼠多个LncRNA明显失调，可作为诊断、预后和治疗AP 的候选生物标志物［5］。肺腺癌转移相关转录因子1（me⁃tastasis⁃associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是LncRNA 重要成员之一，参与多种肿瘤细胞发展和转移过程。研究发现，LncR⁃MALAT1通过靶向结合miRNA 抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移［6］。LncR⁃MALAT1 在胰腺癌细胞中异常高表达，与预后不良有关，但其在AP 中的相关作用报道较少［7］。本研究通过建立体外AP 模型，旨在探讨LncR⁃MALAT1 细胞增殖和凋亡的影响和相关作用机制，以期为临床诊疗AP 提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠胰腺腺泡AR42J 细胞，购于中国科学院上海细胞库。雨蛙素购自美国sigma 公司，FITC/PI 凋亡试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，兔抗大鼠p53 多抗、Bax 多抗、B 淋巴细胞瘤⁃2基因（B⁃cell lymphoma⁃2，Bcl⁃2）多抗、半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteme aspartate specific prote⁃ase⁃3，cleaved⁃caspase⁃3）多抗、山羊抗兔IgG⁃HRP购自美国Abcam 公司，双荧光素酶试剂盒购自美国Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组根据文献［8］，建模前1 d，将AR42J 细胞接种于6 孔板，细胞贴壁后，加入雨蛙素培养基建立体外AP 细胞模型。AP 细胞随机分为AP 组、NC 组、干扰组，另设为对照组。NC 组、干扰组分别转染空载及含有LncR⁃MALAT1⁃siRNA的慢病毒载体，AP 组和对照组细胞不做处理。

1.2.2 指标检测qRT⁃PCR法检测LncR⁃MALAT1、miR⁃181a⁃5p mRNA 表达；MTT 法检测细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blot法检测p53、Bax、Bcl⁃2、Caspase⁃3 蛋白表达。预测LncR⁃MALAT1 与miR⁃181a⁃5p 之间的结合位点，双荧光素酶报告基因实验检测LncR⁃MALAT1与miR⁃181a⁃5p 的靶向关系。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0 分析数据，以（±s）表示计量资料，采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK⁃q检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT⁃PCR 检测mRNA 表达水平敲减LncR⁃MALAT1 后，LncR⁃MALAT1 mRNA 表达水平显著降低，miR⁃181a⁃5p mRNA 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，图1）。

图1 LncR⁃MALAT1、miR⁃181a⁃5p mRNA 表达Fig.1 LncR⁃MALAT1、miR⁃181a⁃5p mRNA expression

2.2 双荧光素酶检测靶向性LncR⁃MALAT1 与miR⁃181a⁃5p 存在连续结合位点，双荧光素酶检测显示LncR⁃MALAT1 与miR⁃181a⁃5p 可以相互结合（图2）。

图2 LncR⁃MALAT1 与miR⁃181a⁃5p 的关系Fig.2 Relationship between LncR⁃MALAT1 and miR⁃181a⁃5p

2.3 MTT 法检测细胞增殖干扰组24、48、72 h 细胞活力高于AP 组、NC 组，且AP 组、NC 组、干扰组细胞活力随着时间延长而下降，差异有统计学意义（P<0.05，表4）。

表4 24、48、72 h 细胞活力比较Tab.4 Comparison of cell viability at 24，48，and 72 hours ±s

表4 24、48、72 h 细胞活力比较Tab.4 Comparison of cell viability at 24，48，and 72 hours ±s

注：与AP 组比较，aP < 0.05；与NC 组比较，bP < 0.05；与24 h 细胞活力比较，*P<0.05；与48 h 细胞活力比较，#P<0.05

组别AP 组NC 组干扰组F 值P 值24 h 细胞活力72.78±7.36 71.36±7.59 85.35±8.62ab 7.215 0.009 48 h 细胞活力58.08±6.02*56.68±5.74*72.84±7.81ab*9.236 0.004 72 h 细胞活力45.12±4.72*#42.63±4.61*#62.13±6.54ab*#19.576<0.001

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡对照组、AP 组、NC 组、干扰组细胞凋亡率分别为（3.02±0.32）%、（28.16±3.31）%、（30.25±3.18）%、（18.64±2.03）%。敲减LncR⁃MALAT1 后，细胞凋亡率显著降低（P<0.05，图3）。

2.5 Western blot 法检测蛋白表达敲减LncR⁃MALAT1后，p53、Bax、cleaved⁃caspase⁃3表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，图4、5）。

3 讨论

图3 细胞凋亡情况Fig.3 Cell apoptosis

图4 各蛋白表达情况Fig.4 Cell protein expression

图5 蛋白免疫印迹图Fig.5 Western blot

临床诊断AP 主要依据患者临床症状、血清学检查及影像学检查等手段，缺乏有效早期分子生物标记物或评判体系［9-10］。研究表明，凋亡在AP中可以作为一种保护机制，诱导凋亡可改善AP 严重程度［11］。LncRNA 与miRNA 共同调控胰腺腺泡细胞的增殖及凋亡过程，探讨其在AP 中的作用机制，对于早期诊断AP 具有积极意义［12-13］。

LncR⁃MALAT1 在胰腺癌细胞系中差异表达，影响细胞增殖、转移和侵袭，并通过调控miRNA，影响癌细胞恶性生物学行为［14-16］。miR⁃181a⁃5p 与AP 严重程度有关，参与介导和调控胰腺组织的修复［17-19］。本研究敲减LncR⁃MALAT1 表达后，miR⁃181a⁃5p 表达显著上调，提示LncR⁃MALAT1 可抑制miR⁃181a⁃5p 表达，进一步发现LncR⁃MALAT1 与miR⁃181a⁃5p 3′UTR 区域特异性结合，双荧光素酶检测显示LncR⁃MALAT1 可特异性与miR⁃181a⁃5p结合，表明LncR⁃MALAT1 通过靶向调节miR⁃181a⁃5p 表达影响AP 细胞增殖及凋亡。

p53 参与抑制细胞增殖、诱导凋亡等过程；p53 可促进Bax、抑制Bcl⁃2 表达，诱导细胞凋亡；cleaved⁃caspase⁃3 蛋白与细胞凋亡程度有关［20］。本研究敲减LncR⁃MALAT1 后，p53、Bax、cleaved⁃cas⁃pase⁃3 蛋白水平显著降低，Bcl⁃2 蛋白水平显著升高，提示敲减LncR⁃MALAT1 可能通过上调miR⁃181a⁃5p 表达，促进细胞增殖抑制细胞凋亡。研究发现，过表达miR⁃181a⁃5p 可以作用于下游p53，减轻心肌凋亡，另外，还可以调节结直肠癌细胞凋亡［21-22］。本研究结果与以上研究结果一致，表明敲减LncR⁃MALAT1 可靶向调控miR⁃181a⁃5p 表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。

总之，LncR⁃MALAT1 参与大鼠AP 细胞增殖及凋亡过程，敲减LncR⁃MALAT1 表达可靶向调控miR⁃181a⁃5p，促进细胞增殖，抑制凋亡，为临床诊治AP 提供新思路和新靶点。LncR⁃MALAT1 对AP细胞作用机制，仍待进一步研究。