miR⁃199a通过Wnt3a/β⁃catenin信号通路调控非小细胞肺癌细胞的生物学活动

庄焕伟 白树堂 符洪犊 曹贤君 梁丽明 陈知群 羊家慧 欧阳华 程弦 张亮

1中南大学湘雅医学院附属海口医院心胸外科（海口570208）；2中山大学附属第七医院胸外科（广东深圳518107）

据2018年WHO 最新统计，肺癌在世界范围内的发病率超过11%，在所有恶性肿瘤中位居第一［1］。根据组织学特征，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non⁃small cell lung carcinoma，NSCLC），其中NSCLC 在肺癌发病人群中占80%以上［2-3］。目前，临床上对于肺癌的治疗主要以手术加化疗为主，但预后差，尤其是化疗对人体毒副作用较大，基因靶向治疗被认为是更精确、安全的治疗方式，其中RNA 干扰和microRNA 等新型靶向基因技术在恶性肿瘤的临床治疗中显示出很好的应用前景。

小分子RNA（microRNA，miRNA）是真核生物细胞内发现的一类长约22 个核苷酸序列的内源性非编码单链RNA，主要通过与目标基因的3′非翻译区（3′UTR）结合，发挥刺激或抑制mRNA 翻译的作用［4］。miR⁃199a 是一类在人类细胞中广泛存在的基因家族，在多种肿瘤组织中异常表达，并能调控多个细胞信号通路参与肿瘤细胞生长增殖、凋亡、侵袭与转移和耐药等生物学过程，与肿瘤的发生、发展及治疗密切相关［5-6］。但其对NSCLC 细胞的生物学活性是否有调控作用鲜有报道。本研究探讨miR⁃199a 对NSCLC 细胞增殖、凋亡、转移和侵袭过程的影响及其可能存在的作用机制，为临床上NSCLC 的基因治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器正常肺上皮细胞BEAS⁃2B和NSCLC 细胞A549均购自中科院上海细胞库；RPMI1640 培养液、胎牛血清（Gibco，美国）；miR⁃199a⁃mimics、miR⁃199a⁃NC 及miR⁃199a⁃inhibito引物序列（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipo⁃fectamineTM2000（Invitrogen，美国）；Annexin V⁃FITC/PI 凋亡试剂盒购自南京Beyotime 公司；CCK⁃8 试剂盒、EdU 试剂盒购自杭州四季青公司；、鼠抗人Wnt3a、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin、E⁃cadherin、Vi⁃mentin 单克隆抗体，羊抗兔二抗购自美国Invitro⁃gen 公司；Trizol 购自美国Invitrogen 公司。

1.2 RT⁃PCR 检测正常肺上皮细胞BEAS⁃2B 和NSCLC 细胞A549 内miR⁃199a 的表达解冻、复苏正常肺上皮细胞BEAS⁃2B 和NSCLC 细胞A549，重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液中，培养在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，每2～3 d 传代1 次，收集对数期细胞，Trizol 提取总RNA，异丙醇处理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗涤，离心，弃上清液，DEPC 水溶解RNA。根据逆转录试剂盒说明，以β⁃actin 为内参进行PCR 扩增，反应条件：95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行灰度扫描分析，比较目的基因与β⁃actin 条带灰度之比。miR⁃199a 上游引物序列：5′⁃TAGGCTTAGCTAGGCTAGGT⁃3′，下游序列5′⁃TCGATTGCTAGGCTAGCC⁃CA⁃3′；β⁃actin 引物序列：5′⁃TAGCTTCGGCATTAG⁃CTAAC⁃3′，下游序列5′⁃TAGGCTTAGCTTAGGCTA⁃GC⁃3′。每个实验结果独立重复3 次。

1.3 细胞培养与转染将冻存的NSCLC细胞A549解冻、复苏，重悬，取对数期细胞进行转染。将细胞转移至6 孔板，调整密度为5×105个/孔，在不含双抗和胎牛血清的培养液中培养24 h，后根据LipofectamineTM2000 试剂盒说明书所示步骤，将miR⁃199a⁃mimics、miR⁃199a⁃NC 及miR⁃199a⁃inhibi⁃tor 序列分别转染至A549 细胞内，根据转染物不同，将细胞分为3 组，分别为mimics 组、NC 组及in⁃hibitor 组，转染6 h 后，将各组细胞转移至完全培养基继续培养，以供后续实验使用。

1.4 CCK⁃8 法检测各组细胞增殖将转染后细胞转移至96 孔板，每孔内加入含2×103个细胞的完全培养基，于转染24、48、72 和96 h 后，向每个实验组细胞培养孔内加入90 μL 的完全培养基和10 μL 的CCK⁃8 试剂，置于培养箱中孵育2 h，用紫外分光光度计检测490 nm 波长处的吸光度，以此代表细胞增殖活性。每个实验结果独立重复3 次。

1.5 Annexin V⁃FITC/PI 联合流式细胞仪检测细胞凋亡细胞转染48 h 后，用预冷PBS 洗涤2 次，将细胞重悬于缓冲溶液中，调整细胞浓度为1×106个/mL，根据凋亡试剂盒说明书中所示步骤，向100 μL 细胞缓冲液中加入5 μL Annexin V⁃FITC 和5 μL PI，避光孵育15 min 后，每管内加入400 μL 缓冲液，使用流式细胞仪检测各转染组细胞凋亡情况。每个实验结果独立重复3 次。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力将转染后的细胞培养24 h 后，弃去培养液，用灭菌的移液枪头垂直于6 孔板底部划直线，PBS 冲掉脱落细胞，于显微镜拍摄并测量划痕宽度，加入完全培养液继续培养，24 h 后再次于显微镜下观察并测量划痕宽度，以24 h 与0 h 划痕宽度之比代表细胞迁移能力，比值越大，代表细胞迁移能力越强，反之越弱。每组细胞设置5 个复孔进行。

1.7 Transwell 小室实验检测细胞侵袭能力向24 孔Transwell 小室的上室中加入预配的Matrigel基质胶（50 μL/孔），细胞转染48 h 后，取对数期细胞，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为2×106个/mL，以100 μL 体积接种于Transwell 小室的上室，下室内加入含血清的培养基600 μL，将小室置于常规细胞培养箱孵育48 h，去除小室，洗膜、固定细胞，结晶紫染色，显微镜下计数。

1.8 双荧光素酶报告实验将对数期A549细胞以2×105/孔的密度接种于24 孔板，用LipofectamineTM2000 将荧光素酶报告载体（Wnt3a⁃3′⁃UTR⁃WT 或Wnt3a⁃3′UTR⁃MT）与miR⁃199a⁃mimics/inhibitor/NC共转染细胞，以Renilla 荧光素酶质粒（100 ng/孔）为对照，与载体共转染。转染48 h后，用双荧光素酶报告分析系统（Promega）检测荧光素酶活性。

1.9 Western blot检测各组细胞Wnt3a、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin、E⁃cadherin 和Vimentin 蛋白表达细胞转染48 h 后，收集各组细胞，RIPA 裂解液提取总蛋白，将蛋白样品加入SDS⁃PAGE 凝胶加样孔进行电泳，使蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶室温封闭2 h，TBST 温和洗膜3 min 后加入相对应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤10 min×3 次，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST 洗涤10 min×3 次，加入配制好的ECL 发光液，避光孵育5 min，化学发光凝胶成像仪中采集图片信息，图片用Image pro plus 6.0 软件进行灰度分析。每个实验结果独立重复3 次。

1.10 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行统计学处理；正态分布计量资料以均数±标准差表示，多组计量资料间比较采用ANOVA 检验，组内两两比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃199a 在肺癌细胞中的表达高于正常肺上皮细胞正常肺上皮细胞BEAS⁃2B 中miR⁃199a的相对表达量为（0.83±0.04），NSCLC 细胞A549中miR⁃199a 的相对表达量为（0.31±0.02），显著低于正常肺上皮细胞内的表达（P<0.05）。见图1。

图1 RT⁃PCR 检测正常肺上皮细胞BEAS⁃2B 和NSCLC细胞A549 内miR⁃199a 的表达Fig.1 RT⁃PCR detection of miR⁃199a expression in normal lung epithelial cells BEAS⁃2B and non⁃small cell lung cancer cells A549

2.2 miR⁃199a 能抑制NSCLC 细胞的增殖自转染48 h 起，mimics 组细胞增殖活力显著低于其他两组（P< 0.05），而inhibitor 组细胞的增殖活力在3 组中最高（P< 0.05），这种趋势一直持续至96 h。见图2。

图2 CCK8 法检测miR⁃199a 对A549 细胞增值率的影响Fig.2 CCK8 assay to detect the effect of miR⁃199a on the proliferation rate of A549 cells

2.3 miR⁃199a能促进NSCLC细胞的凋亡细胞转染48 h后，inhibitor组细胞凋亡率为（3.32±0.44）%，NC组细胞凋亡率为（13.93±0.73）%，mimics 组细胞凋亡率为（25.10±0.56）%。其中inhibitor 组凋亡率低于其他两组（P< 0.05），mimics 组细胞凋亡率显著高于其他两组（P<0.05）。见图3。

图3 PITC/PI 联合流式细胞仪检测miR⁃199a 对A549 细胞凋亡率的影响Fig.3 PITC/PI combined with flow cytometry to detect the effect of miR⁃199a on the apoptosis rate of A549 cells

2.4 miR⁃199a 能抑制细胞迁移和侵袭划痕实验检测miR⁃199a 对A549 细胞迁移能力的影响，结果显示，24 h 后mimics 组细胞划痕宽度为0 h的（28.74±1.26）%，NC 组为（63.63±3.22）%，显著高于mimics 组（P< 0.05），inhibitor 组为（93.48±2.88）%，在3 组中为最高（P<0.05），见图4。

Transwell 小室实验检测miR⁃199a 对A549 细胞侵袭能力的影响，结果显示，mimics 组单位面积内穿过小室纤维膜细胞数为（98.83±9.70）个，NC 组单位面积内穿过小室纤维膜细胞数为（27.39±4.66）个，显著低于mimics 组（P< 0.05），inhibitor组单位面积内穿过小室纤维膜细胞数为（11.86±2.01）个，显著低于其他两组（P<0.05），见图5。

图4 划痕实验检测不同组别细胞迁移能力Fig.4 Scratch test to detect cell migration ability in different groups

图5 Transwell 小室实验检测miR⁃199a 对A549 细胞侵袭能力的影响Fig.5 Transwell chamber experiment to detect the effect of miR⁃199a on the invasion ability of A549 cells

2.5 miR⁃199a 靶向抑制A549 细胞中Wnt3a 的表达为了确定miR⁃199a 在A549 细胞中发挥生物学功能的靶向作用点，笔者使用TargetScan 软件筛选miR⁃199a 潜在下游靶向蛋白，预测发现miR⁃199a 与Wnt3a 保守位点有高分数结合（图6A），Wnt3a 为miR⁃199a 的一个潜在作用靶点。本研究双荧光素酶报告系统结果显示，miR⁃199a⁃mimics抑制了A549 细胞中Wnt3a⁃3′⁃UTR⁃WT 报告基因的荧光素酶活性，而miR⁃199a⁃Inhibitor 刺激了Wnt3a⁃3′⁃UTR⁃WT 报告基因的荧光素酶活性，差异具有统计学意义（P< 0.05），而在转染突变载体的细胞内没有观察到荧光素酶活性改变，表明Wnt3a是miR⁃199a 的直接靶向蛋白见（6B）。同时，用Western blot 检测了miR⁃199a 表达不同的细胞内Wnt3a 的蛋白表达情况，结果显示转染了miR⁃199a mimics的细胞内Wnt3a的表达显著低于转染空白质粒组细胞（P< 0.05），而转染miR⁃199a 抑制剂的细胞内Wnt3a 的表达显著高于其他两组（P<0.05，图6C、D）。

图6 miR⁃199a 靶基因确定Fig.6 Identification of miR⁃199a target gene

2.6 miR⁃199a 能刺激A549 细胞内E⁃cadherin 表达，抑制Vimentin、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin的蛋白表达Western blot 检测转染不同质粒的A549 细胞中Wnt 信号通路中相关蛋白的表达，结果显示，转染miR⁃199a 类似物的细胞中，E⁃cadherin 表达显著高于NC 组细胞，而Vimentin、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin 的表达低于NC 组细胞，差异均具有统计学意义（P< 0.05），转染miR⁃199a 抑制剂的细胞内，E⁃cadherin 表达低于NC 组细胞，而Vimentin、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin 的表达高于NC 组细胞，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见图7。

3 讨论

miR⁃199a 被证实在多种肿瘤细胞中作为癌基因或抑癌基因异常表达，同时调控肿瘤细胞的生物学行为［5-6］。研究发现，相对于正常组织，miR⁃199a 在肝癌、膀胱癌、食管癌等多种肿瘤细胞内的表达明显低于正常组织，miR⁃199a表达增加后，肿瘤细胞的增殖、生长受到抑制，凋亡率显著增加［7-8］，说明miR⁃199a 在这些肿瘤组织内发挥抑制基因的作用。SAKAGUCHI 等［9］研究发现，miR⁃199a 通过靶向作用ITGA3 抑制膀胱癌细胞的转移侵袭；ZHOU 等［10］的实验结果显示miR⁃199a 通过CCR7调控膀胱癌细胞的上皮间质转化（EMT）过程，发挥抑癌基因的作用；PHATAK等［11］报道称miR⁃199a⁃3p通过靶向p21 激酶4 降低食管癌细胞增殖活性。本研究为了探讨miR⁃199a 对NSCLC 细胞的生物学功能是否有调控作用，首先检测了其在正常肺上皮细胞和NSCLC 细胞中的表达，结果显示，miR⁃199a在NSCLC 细胞中的表达明显低于正常肺上皮细胞，同时，本研究检测了miR⁃199a 表达程度不同的A549 细胞的生物活性，结果显示，过表达miR⁃199a的细胞增殖、转移和侵袭活性均显著低于低表达miR⁃199a 的细胞，而凋亡率显著上升，而低表达miR⁃199a 的细胞增殖、转移和侵袭活性增强，凋亡率下降，以上结果提示miR⁃199a 在NSCLC 中可能作为抑癌基因发挥作用。

为了进一步探究miR⁃199a 对NSCLC 细胞的作用机制，笔者在miRNA 数据查询发现Wnt3a 3′⁃UTR 中存在其目标碱基序列。Wnt/β⁃catenin 信号通路在肿瘤细的增殖、凋亡及间质化过程中发挥重要作用，该通路的异常激活与多种癌症的发生有密切关系，其中Wnt3a 是该通路的重要配体之一［12］，多项研究显示，Wnt3a 参与了NSCLC 的病理过程，YU 等［13］证实CSF⁃1R 通过Wnt3a 信号传导调节NSCLC 细胞的扩散；HAN 等［14］发现银杏外种皮提取物通过Wnt 3a/β⁃catenin 信号通路抑制Lewis 肺癌发生。本研究中，用双荧光素酶报告实验证实miR⁃199 可明显减弱野生型Wnt3a3′⁃UTR的荧光酶活性，而对突变型Wnt3a3′⁃UTR 的荧光酶活性无影响，同时，转染miR⁃199a 类似物的细胞内Wnt3a 的蛋白水平显著低于转染miR⁃199a 抑制序列的细胞，提示miR⁃199a 可靶向抑制Wnt3a的表达。

为了进一步研究miR⁃199a 对NSCLC 细胞调控作用的分子机制，本研究在3 组miR⁃199a 不同表达的A549 细胞中检测了一系列Wnt3a/β⁃catenin 信号通路的下游分子。当Wnt 信号通路被异常激活时，β⁃catenin 在细胞内逐渐聚集，继而进入细胞核内聚集，激活下游一系列靶基因的表达，既往研究［15］表明，β⁃catenin 在A549 细胞中高表达，对维持A549 细胞增殖和克隆形成能力有促进作用。本研究结果发现，随着Wnt3a 在miR⁃199a⁃mimics组细胞中被抑制，β⁃catenin 的表达也随之减弱，同时，miR⁃199a⁃inhibitor 组细胞内β⁃catenin 表达较miR⁃199a⁃NC 组显著增加。C⁃myc 是Wnt/β⁃catenin通路的一个下游靶基因，其在细胞周期、细胞增殖过程中能使细胞无限增殖，获得永生化能力，并且能促进细胞分裂［16-17］。Survivin 是Wnt/β⁃catenin 通路的另一个靶基因，主要表达于胚胎组织及肿瘤细胞中，属于凋亡抑制蛋白，其主要在细胞周期的G2/M 期发挥作用，通过抑制caspase⁃3 的活性而阻断细胞的凋亡［18-19］。本研究结果发现，miR⁃199a能抑制A549 细胞内C⁃myc、Survivin 的表达，提示miR⁃199 对A549 细胞增殖、凋亡的影响可能是通过Wnt/β⁃catenin 通路对C⁃myc、Survivin 的调控而实现的。

EMT 指源于上皮的肿瘤细胞失去极性而向具有间质表型细胞转化的过程，在此过程中，上皮细胞黏附性降低，极性消失，使细胞的转移和侵袭能力增强［20-21］，Wnt/β⁃catenin 信号通路是导致EMT的重要因素［22］，EMT过程的重要标志是细胞内上皮细胞的主要成分上皮型钙黏蛋白（E⁃cadherin）表达下降，间质细胞的主要成分波形蛋白（Vimentin）等能刺激细胞移动的蛋白表达上调，二者都为Wnt/β⁃catenin信号通路的下游蛋白［23-25］。本研究检测了miR⁃199a 对E⁃cadherin、Vimentin 表达的影响，结果发现，miR⁃199a 能抑制二者在A549 细胞中的表达，这种抑制作用可能是通过对Wnt/β⁃catenin通路活性的下调而实现的，同时也进一步解释了miR⁃199a 对A549 细胞的迁移、侵袭活性下调的分子机制。

本研究探讨了miR⁃199a 对NSCLC 细胞生物学活动的调控作用，并对其作用机制进行了初步探讨，不足之处在于范围只限于细胞水平，而未进行体内实验。本课题组在下一步的研究中会探究miR⁃199a 在NSCLC 组织中的表达及其与临床病理特征间的关系，为miR⁃199a 在非小细胞肺腺癌中发挥作用提供更充足的证据。综上所述，miR⁃199a能抑制NSCLC A549 的增殖、迁移和侵袭，同时刺激其凋亡，这种作用可能是通过靶向抑制Wnt3a/β⁃catenin 信号通路的活性而实现的。

图7 Western blot 检测miR⁃199a 对A549 细胞内E⁃cadherin、Vimentin、β⁃catenin、C⁃myc、Survivin 的蛋白表达Fig.7 Western blot detected miR⁃199a protein expression of E⁃cadherin，Vimentin，β⁃catenin，C⁃myc，and Survivin in A549 cells