熊果酸对1型糖尿病大鼠转录因子T⁃bet/GATA⁃3表达的影响

2020-10-19宋超杰张小莉陈维维于莹莹陈换换

实用医学杂志 2020年18期

宋超杰张小莉陈维维于莹莹陈换换

河南中医药大学（郑州450046）

1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1DM）是胰岛β细胞受损导致胰岛素绝对缺乏的慢性自身免疫性疾病，常表现为外源性胰岛素依赖［1］。患者以青少年为主，部分发病急，血糖波动大，易发生视网膜病变［2］、酮症酸中毒，甚至死亡。目前，T1DM 的治疗仍以终身注射胰岛素为主［3］，新型治疗手段包括胰岛移植［4］、干细胞疗法［5］等，但由于供体有限、技术要求高、费用昂贵等因素，仍不能取代胰岛素疗法；若长期注射胰岛素，可使机体产生胰岛素抗体，血糖不稳定易造成慢性心血管并发症［6］，因此寻找新的替代药物显得尤为重要。

现有研究［7-8］表明Th1/Th2 细胞分化失衡并偏向Th1 方向可导致T1DM 发生，纠正Th1/Th2 细胞失衡可改善T1DM［9］。转录因子T⁃bet、GATA⁃3 分别在Th1 和Th2 细胞中特异性表达，是Th0 细胞分化方向的重要决定因素，T⁃bet/GATA⁃3 表达比值的变化可反映Th1/Th2 分化状况与自身免疫性疾病发病机制、发展和预后的关系［10］。最新研究［11］表明，下调T⁃bet 的表达可纠正Th1/Th2 细胞失衡从而改善T1DM。中药提取物熊果酸（ursolic acid，UA），具有降糖、降脂、抑菌、抗氧化等作用［12-15］，但UA 的降糖机制尚在研究，UA 能否通过调控转录因子T⁃bet、GATA⁃3 的表达发挥降糖作用，目前尚无相关研究。

本研究通过复制T1DM 大鼠模型，UA 灌胃6 周后，检测T⁃bet、GATA⁃3 的转录及蛋白表达情况，探讨UA 能否通过调控T⁃bet、GATA3 的表达，纠正Th1/Th2 细胞因子失衡，从而发挥降糖作用，对寻找治疗T1DM 的药物作用新靶点及UA 的临床应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.1.1 试剂UA（纯度95%，毕得医药，批号：WG0009285⁃180525001）；盐酸二甲双胍片（0.25 g/片，上海上药信宜药厂有限公司，批号：48171122）；链脲佐菌素（纯度98%，北京Solarbio 生物科技有限公司，批号：S49163）；大鼠胰岛素（INS）ELISA 试剂盒（Invitrogen 公司，批号：0743021419）；大鼠IL⁃2（批号：12113112813）、IL⁃4（批号：1281475824）ELISA试剂盒、兔多抗GATA3（48 KD）（批号：BA0885）、兔多抗T⁃bet（TBX21，58 KD）（批号：BA1711）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（批号：BA1054）均购自武汉博士德生物工程有限公司；大鼠insulin 抗体（批号：LS192819）、HRP 标记山羊抗兔试剂盒（批号：HP191908）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；BCA 蛋白测定试剂盒（碧云天公司，批号：P0010）；兔多抗GAPDH（贤至生物有限公司，批号：AB⁃P⁃R 001）；ECL 底物液（Thermo 公司，批号：NCI5079）；X 光胶片（柯达公司，批号：XBT⁃1）；显影定影试剂盒（天津市汉中摄影材料厂）；总RNA提取试剂盒（Solarbio 公司，批号：R1200）；逆转录试剂盒、SYBR Green 核酸染料（诺唯赞）；PCR 引物合成（江苏金唯智生物科技有限公司）。

1.1.2 仪器血糖仪（鱼跃医疗设备股份有限公司）；酶标仪（Thermo 公司）；垂直电泳槽（北京六一仪器厂，型号：DYCZ⁃24DN）；垂直湿转膜槽（美国Bio⁃Rad 公司，型号：Trans⁃Blot Cell）；电泳仪电源（美国Bio⁃Rad 公司，型号：DYY⁃7C）；实时荧光定量PCR 仪（ABI 公司，型号：7500）；脱色摇床（美国Kylin⁃Bell Lab Instruments 公司，型号：TS⁃2）。

1.1.3 动物60 只Wistar 大鼠，雄性，6 周龄，170～180 g，SPF 级，购自济南朋悦有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20140007。饲养于河南中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（豫）2015⁃0005，动物伦理编号：DWLL2018030032；饲料购自江苏省协同医药生物工程有限公司，许可证号：苏饲证（2014）01008。

1.2 方法

1.2.1 造模及给药60 只健康雄性Wistar 大鼠，IVC 独立通风，随机分空白组（n=10）、造模组（n=50）。适应性喂养7 d 后，造模组以55 mg/kg 剂量一次性腹腔注射1%链脲佐菌素，空白组注射等体积柠檬酸⁃柠檬酸钠缓冲液。7 d 后，连续3 d 在同一时间检测空腹血糖，若≥16.7 mmol/L，视造模成功。造模成功大鼠再随机分为模型组（n=12）、二甲双胍组（n=12）和UA 组（n=12）。治疗组每天灌胃100 mg/kg 相应药物，空白组和模型组用等体积羧甲基纤维素钠溶液（5 g/L）灌胃，根据各组大鼠每周的体质量，调整灌胃药物的体积，持续6 周后，麻醉取材。

1.2.2 样本采集麻醉后，经腹主动脉采集血液，待血液凝固后4 ℃离心分离血清装入冻存管，立即转入液氮速冻，之后转入-80 ℃冻存。分离胰腺，放入4%甲醛溶液中固定；分离脾脏，立即装入冻存管，先转液氮速冻，之后-80 ℃冻存。

1.2.3 一般情况每天观察并记录大鼠活动；每周同一时间测体质量、空腹血糖，测空腹血糖时空腹8 h，禁食不禁水，尾尖采血。

1.2.4 免疫组化染色观察胰腺病理改变胰腺固定24 h后，按照试剂盒说明进行脱水、包埋、4 μm 切片，进行胰岛素的免疫组化染色，光镜下观察胰岛破坏及炎症浸润情况。

1.2.5 ELISA法检测血清中INS、IL⁃2、IL⁃4的表达量严格按照说明书上步骤进行操作，用450 nm波长检测OD 值，绘制标准曲线，依据标准曲线计算浓度。

1.2.6 qRT⁃PCR 法检测T⁃bet、GATA⁃3 mRNA 表达用RNA 提取试剂盒提取脾脏总RNA，微型分光光度计检测A260/A280比值，用20 μL 反应体系即：2×RT Mix 10 μL；HiScript ⅡEnzyme Mix 2 μL；Oligo（dT）23VN（50 μmol/L）1 μL；Random hexamers（50 ng/μL）1 μL；Total RNA 1 pg⁃1 μg（根据所测得RNA浓度而定）；RNase free ddH2O 加至20 μL，退火：25 ℃，5 min；延伸：50 ℃，15 min；失活：85 ℃，2 min，逆转录为cDNA，-20 ℃冻存；用20 μL 反应体系（2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；Primer1 0.4 μL；Primer2 0.4 μL；Template cD⁃NA 1 μL；ddH2O 8.2 μL），95 ℃5 min 预变性，95 ℃10 s，60 ℃60 s，40 个循环扩增，绘制溶解曲线用2⁃△△CT法计算基因的相对表达量。PCR 引物设计如下：β⁃actin 正义链：5′⁃CACCCGCGAGTA⁃CAACCTTC⁃3′；反义链：5′⁃CCCATACCCACCATCA⁃CACC⁃3′；T⁃bet 正义链5′⁃AAGGCAGTATGC⁃CAGGGAAC⁃3′；反义链：5′⁃TTGGAGCCCCCTTGTT⁃GTT⁃3′；GATA⁃3 正义链：5′⁃ATGGAGGTGACTACG⁃GACCA⁃3′；反义链：5′⁃TAGTAGGACGGGACGTG⁃GTT⁃3′。

1.2.7 Western blot 法检测T⁃bet、GATA⁃3 蛋白表达脾脏匀浆提取总蛋白，测定浓度、电泳、转膜、一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，ELC 显色，扫描，BandScan 分析计算灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析（One⁃way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况正常组毛发柔顺亮白，灵活好动；模型组出现“三多一少”症状，毛发潮湿枯黄，精神倦怠，死亡2 只。UA 组与二甲双胍组“三多一少”症状改善，毛发干燥泛黄，精神好转；与模型组比，UA 组体质量持续增加（P< 0.01），空腹血糖降低（P<0.01）。见表1、2。

表1 UA 对T1DM 大鼠体质量的影响Tab.1 Effect of UA on body weight of T1DM rats ±s，g

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数12 10 12 10灌胃0 周192.83±16.27 190.50±10.85**204.83±7.01 246.33±12.17灌胃2 周257.00±14.04##183.80±10.85**263.42±12.71##323.83±19.73灌胃4 周304.33±19.31##193.10±8.61**282.00±16.02##366.00±28.71灌胃6 周321.42±14.66##201.60±7.51**296.42±23.03##411.75±32.11

表2 UA 对T1DM 大鼠空腹血糖的影响Tab.2 Effect of UA on fasting blood glucose in T1DM rats ±s，mmol/L

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数12 10 12 10灌胃0 周25.19±4.58 28.57±2.82**27.23±3.98 6.01±0.60灌胃2 周18.28±4.52#29.44±2.64*18.09±3.67##5.00±0.66灌胃4 周12.2±2.98#28.72±2.81*12.03±2.42##4.93±0.46灌胃6 周8.98±2.61##26.64±2.67**8.81±1.91##4.88±0.49

2.2 血清胰岛素变化与空白组比，模型组血清胰岛素含量降低（P< 0.01）；与模型组比，二甲双胍组、UA 组胰岛素含量升高（P<0.01），见表3。

表3 UA 对T1DM 大鼠血清INS 的影响Tab.3 Effects of UA on serum insulin in T1DM rats ±s，μIU/mL

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数12 10 12 10 INS（μIU/mL）13.64±2.07##5.70±0.73**13.38±2.30##15.17±2.18

2.3 病理改变苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的胰岛素阳性表达为棕黄色。空白组胰岛β细胞胞浆丰富、胞核蓝染，整齐排列；模型组胰岛萎缩，胰岛β细胞明显减少，排列散乱，部分出现水肿、空泡样变性、组织间隙炎性细胞浸润；二甲双胍组、UA 组胰岛边界较清晰，形态较规则，胰岛β细胞分布较均匀，水肿变性得到抑制，组织损伤程度减轻，见图1。

2.4 IL⁃2、IL⁃4 变化与空白组比，模型组血清IL⁃2 含量升高（P< 0.01）、IL⁃4 降低（P< 0.01）；与模型组比，UA 组IL⁃2 表达量降低（P< 0.01），IL⁃4升高（P<0.01），见表4。

2.5 T⁃bet、GATA⁃3 mRNA变化与空白组比，模型组脾脏T⁃bet mRNA 水平升高（P< 0.01），GATA⁃3 mRNA 降低（P< 0.01），T⁃bet/GATA⁃3 比值升高（P<0.01）；与模型组比，UA 组T⁃bet mRNA 表达量降低（P<0.01），GATA⁃3 mRNA 升高（P<0.05），T⁃bet/GATA⁃3比值降低（P<0.01），如表5、图2所示。

图1 UA 对T1DM 大鼠胰腺病理变化的影响（HE，×400）Fig.1 Effect of UA on pathological changes of pancreas in T1DM rats（HE，×400）

表4 UA 对T1DM 大鼠IL⁃2、IL⁃4 表达量的影响Tab.4 Effect of UA on the expression of IL⁃2 and IL⁃4 in T1DM rats ±s

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数12 10 12 10 IL⁃2（pg/mL）92.10±1.12##147.5±2.01**106.97±4.17##87.57±1.11 IL⁃4（pg/mL）59.37±3.47##41.87±0.34**56.03±2.70##60.73±7.52

表5 UA 对糖尿病大鼠脾脏内T⁃bet、GATA⁃3 mRNA 表达量的影响Tab.5 Effect of UA on the expression of T⁃bet and GATA⁃3 mRNA in spleen of diabetic rats ±s

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型相比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数6 6 6 6 T⁃bet mRNA 1.50±0.23##2.75±0.66**1.32±0.26##1 GATA⁃3 mRNA 0.67±0.037#0.17±0.06**1.04±0.22##1

图2 T⁃bet、GATA⁃3 的mRNA 表达量比值Fig.2 Expression ratio between T⁃bet and GATA⁃3 mRNA

2.6 T⁃bet、GATA⁃3蛋白表达情况与空白组比，模型组脾脏T⁃bet 蛋白水平升高（P< 0.01），GATA⁃3蛋白水平下调（P<0.01）；与模型组比，UA 组T⁃bet蛋白水平下降（P< 0.01），GATA⁃3 水平上升（P<0.01），见表6、图3。

表6 UA 对糖尿病大鼠脾脏内T⁃bet、GATA⁃3 蛋白表达量的影响Tab.6 Effect of UA on the expression of T⁃bet and GATA⁃3 protein in spleen of diabetic ±s

注：与空白组比，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比，##P<0.01，#P<0.05

组别UA 组模型组二甲双胍组空白组例数6 6 6 6 T⁃bet 0.17±0.00##0.68±0.03**0.31±0.02##0.10±0.00 GATA⁃3 0.61±0.06##0.12±0.02**0.41±0.04##0.69±0.03

图3 UA 对T1DM 大鼠脾脏内T⁃bet、GATA⁃3 蛋白表达水平影响Fig.3 Effect of UA on T⁃bet and GATA⁃3 protein expression in spleen of T1DM rats

3 讨论

目前，中国T1MD 患者（0～19 岁）居世界第4 位［16］，患者常起病急，易出现酮症酸中毒、视网膜病变等并发症，严重影响患者身心健康［17-18］。目前治疗T1DM 的金标准为胰岛素注射，但患者需终身用药［3］；胰岛移植、干细胞疗法及中药治疗效果明显，其作用机制尚在研究［5，19-20］。UA 为中药提纯物，存在于山楂、女贞子、车前草等植物［21］，具有降糖、抗菌消炎、抗肿瘤等作用［22-23］。但其降糖作用机制尚在研究。

T1DM 的发病机制中，除自身抗体外［24］，现有研究表明，Th1/Th2 细胞分化失衡偏向Th1 方向和由此产生的细胞因子表达量的改变在T1DM 发病机理中起重要作用［8］。DUAN 等［25］通过二甲双胍抑制NOD 小鼠的Th1 及Th17 细胞分化可改善其自身免疫性胰岛炎。转录因子T⁃bet 特异性表达于Th1 细胞。GATA⁃3 控制CD4+T 细胞分化，调控Th2 细胞。转录因子T⁃bet/GATA⁃3 可能在疾病发生发展过程中，通过参与正向或负向调控Th1/Th2的分化来维持平衡，达到减轻、治疗疾病目的［26］。TANG 等［27］通过抗CD20 单克隆抗体与腺病毒载体介导的IL⁃10 组合上调NOD 小鼠GATA3 及IL⁃4 的表达，下调T⁃bet 的表达，发现其对早期NOD 小鼠的胰岛β细胞具有保护作用。IL⁃2 为Th1 型细胞因子，过表达可使CD4+T 细胞表达粘附分子高，损伤β细胞，诱发T1DM［28］；IL⁃4 主要由Th2 细胞产生，ALLAM 等［29］通过使用具有序列特异性引物的PCR 对300 例T1DM 患者和300 例对照受试者细胞因子单核苷酸多态性进行分析，发现IL⁃4⁃590C/T TT 纯合子比CC 基因型更容易发生T1DM，IL⁃4 T等位基因与T1DM 患者之间有一定联系。脐带间充质干细胞移植可增加IL⁃4 水平，纠正Th1/Th2 失衡，降低血糖，改善T1DM 症状［30］。因此，通过调控T⁃bet/GATA⁃3 进而纠正Th1/Th2 细胞及细胞因子失衡是改善T1DM 关键。本研究结果表明，与模型组比，UA 可使转录因子GATA⁃3 转录增加、表达上调，T⁃bet 转录及表达下降，T⁃bet/GATA⁃3 比值升高，细胞因子IL⁃2 含量降低，IL⁃4 升高，说明UA 作用后，在转录因子T⁃bet/GATA⁃3 的调控下，Th1/Th2型细胞因子的表达开始偏向Th2 方向，Th1/Th2 细胞因子分化失衡状况得到纠正，T1DM 得以改善，与上述研究结果一致。MA 等［31］研究发现UA 通过作用于靶点CASP3、ERK1 和JNK2，减轻炎症相关下游多种信号转导因子，具有抗炎活性，由此可推断UA 可能通过作用于上述靶点，进而下调T⁃bet的表达，从而抑制Th1 细胞分化，改善T1DM。

由于样本量有限，本实验只探讨了UA 调控转录因子T⁃bet/GATA⁃3 的表达，但其具体调控途径尚未可知，还需使用相关的抑制剂和激动剂进一步探讨，以确定T⁃bet/GATA⁃3 的关键作用，这将在本课题的下一步研究中继续探讨。

综上所述，本研究表明中药提取物UA 能够通过下调T⁃bet、上调GATA⁃3 的表达，增加Th1 型细胞因子IL⁃2 的表达，降低Th2 型细胞因子IL⁃4 的表达，进而纠正Th1/Th2 细胞分化失衡，从而抑制胰腺炎症反应、降低血糖，有效改善T1DM。本研究可为UA 降糖机制的阐明及临床应用提供重要理论支持。