北京市某院难辨梭菌临床分离株耐药性及毒素基因携带情况分析

邵冬华，宋 燕，梁国威

（航天中心医院检验科，北京 100049）

难辨梭菌感染目前已经成为院内感染的主要威胁之一，在一些特定区域甚至超过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌而成为院感防控最棘手的问题[1]。难辨梭菌的致病性与其产生的2种致病毒素有关。A毒素（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）为肠毒素，能趋化中性粒细胞浸润回肠壁释放细胞因子，导致液体大量分泌和肠壁出血坏死；B毒素（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）为细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，致细胞团缩坏死，能直接损伤肠壁细胞。临床致病菌株以携带A、B 2种毒素基因（即A+B+菌株）多见，A毒素也一直被认为是难辨梭菌引起腹泻的主要致病因素。近年来的研究发现，临床分离的部分菌株编码A毒素的基因tcdA常出现110 bp的缺失，这种携带缺失的tcdA基因的菌株，即A-B+菌株，在欧洲及亚洲的一些国家相继出现，同样可以引起腹泻，甚至引发伪膜性肠炎[2]。航天中心医院相关性腹泻（Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD）的既往治疗用药物主要为甲硝唑和万古霉素。但近年来难辨梭菌对甲硝唑和万古霉素的敏感性呈逐年降低的趋势，因此监测难辨梭菌对常用抗菌药物的敏感性非常重要。本研究对航天中心医院难辨梭菌的耐药性及致病菌株携带A、B毒素情况进行初步分析，以期为临床治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2015年3月—2016年5月航天中心医院住院期间出现不明原因腹泻患者的粪便样本335例。

1.2 主要试剂和仪器

MASTER MIX [天根生化科技（北京）有限公司]，ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），厌氧菌培养系统（荷兰ANOXOMAT公司），质谱仪及难辨梭菌鉴定培养基（chromIDClostridium difficileagar，CDIF）（法国生物梅里埃公司），厌氧血平板（天津金章公司），阿莫西林、甲硝唑、克林霉素、万古霉素、莫西沙星、氨苄西林-舒巴坦、美罗培南药物敏感性试验纸条（郑州安图公司），难辨梭菌标准菌株（ATCC 9689）由中日友好医院赠送。

1.3 方法

1.3.1 样本处理 取粪便样本180～220 mg，置于2 mL离心管中。按试剂说明书要求加入500 μL SA缓冲液、100 μL SC缓冲液、15 μL Proteinase K，间歇振荡1 min至样本充分混匀。95 ℃孵育15 min，孵育过程中震荡2～3次，涡旋震荡15 s，再13 400×g离心3 min，分离上清液至新的离心管中，加入10 μL RNase A，震荡混匀后室温放置5 min。加入200 μL SH缓冲液，震荡混匀，13 400×g离心3 min，收集上清液，置于0.5 mL Eppendorf管中，-20 ℃保存备用。

1.3.2 粪便样本tpi及A、B毒素基因检测 参照文献[3]，采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测难辨梭菌tpi基因及A、B毒素基因。反应体系均为20 μL，其中细菌基因组DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，TaqMan-MGB探针1 μL。反应条件：95 °C 2 min，95°C 15 s，57 °C 1 min，40个循环。引物序列见表1。

表1 难辨梭菌tpi、tcdA、tcdB、tcdAT引物及探针序列

1.3.3 难辨梭菌培养及鉴定 在难辨梭菌tpi基因阳性的粪便样本中加入等体积无水乙醇，充分混匀后室温放置30 min。用接种环蘸取预处理过的粪便接种于CDIF，厌氧培养48 h，以培养基上呈现典型的灰色或黑色菌落为可疑菌落。采用质谱仪进一步验证可疑菌落，以确保鉴定结果准确无误。挑取确定为难辨梭菌的单个菌落接种于厌氧血平板进行传代，通过分离纯化获得更多的高纯度难辨梭菌菌株。

1.3.4 体外药物敏感性试验 根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2016年标准，采用E试验进行药物敏感性试验。

1.3.5 患者一般情况比较 比较检出A+B+菌株和A-B+菌株的患者的病史、临床用药史、实验室检测结果是否存在差异。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，非正态分布数据经对数转换为正态分布，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粪便样本tpi基因及A、B毒素基因检测结果

335例粪便样本中，56例检出tpi基因（16.7%）。其中10例（17.9%）检出A-B+菌株，46例（82.1%）检出A+B+菌株。tpi基因阳性菌株病区来源见图1。

图1 tpi基因阳性菌株病区来源

2.2 细菌鉴定及体外药物敏感性试验结果

56株tpi基因阳性菌株经质谱仪鉴定，均确定为难辨梭菌，其耐药性见表2、表3。

2.3 A+B+菌株和A-B+菌株感染患者临床特征比较

46例检出A+B+菌株的患者年龄（76.1±14.3）岁，其中男27例（58.6%），年龄（75.7±15.4）岁；10例检出A-B+菌株的患者中，男7例（70.0%），年龄（78.6±6.8）岁。检出A+B+菌株和A-B+菌株男性患者所占比例及年龄比较无差异（P＞0.05）。检出2种菌株的患者既往病史、临床用药史、常规实验室检测指标比较无差异（P＞0.05），见表4～表6。

表2 56株tpi阳性难辨梭菌对7种抗菌药物的耐药率

表3 多重耐药菌株耐药模式

表4 检出2种菌株的患者既往病史比较 例（%）

表5 检出2种菌株的患者临床用药史比较 例（%）

表6 检出2种菌株患者实验室检测指标比较 ±s

表6 检出2种菌株患者实验室检测指标比较 ±s

注：*表示对原始数据进行对数转换后的数据值

淋巴细胞/中性粒细胞比值菌株 白细胞计数/（×109/L）中性粒细胞百分比/%淋巴细胞百分比/%C反应蛋白/（mg/L）血肌酐/（mmol/L）白蛋白/（g/L）A+B+菌株 2.21±0.54* 73.35±11.72 17.65±9.08 3.05±0.70* 3.17±0.95* 4.05±0.44* 31.43±5.23 A-B+菌株 2.30±0.35* 74.03±12.11 17.56±12.1 2.94±0.92* 3.77±1.05* 4.28±1.06* 31.72±5.24 P值 0.615 0.868 0.980 0.648 0.101 0.269 0.875

3 讨论

2017年，美国感染病协会和美国医疗保健流行病学学会推荐采用核酸扩增方法诊断难辨梭菌感染[4]。本研究采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对335例临床不明原因腹泻患者的粪便样本进行快速筛查。该方法直接提取粪便DNA检测难辨梭菌菌属tpi基因及毒素基因。由于tpi的编码基因是难辨梭菌的管家基因，具有种的特异性，是难辨梭菌区别于其他细菌的特异性基因，可应用于临床样本中难辨梭菌的快速筛选检测[5]。本研究335例粪便样本中有56例检出难辨梭菌，其中10株（17.9%）A-B+菌，46株（82.1%）A+B+菌。A-B+菌株的分离率存在着地区差异，在欧洲及北美地区的分离率为0.2%～8.0%[6]，韩国和泰国的分离率曾达到40%[7-8]。A、B毒素在致病性方面也存在争议，A毒素曾被认为是引起腹泻的主要原因，B毒素在艰难梭菌致病性方面起至关重要的作用，不同地区2种菌株所致疾病的严重程度和临床特征也不尽相同。A-B+菌株既可以无症状定植，也可以引起伪膜性肠炎，A-B+菌株比A+B+菌株更易引起伪膜性肠炎[9]。本研究56例患者的年龄、性别、既往病史、临床用药史以及实验室检测结果差异均无统计学意义（P＞0.05），与KIM等[10]的研究结果一致。

近年来，难辨梭菌对甲硝唑和万古霉素的敏感性呈逐年降低趋势，并出现了耐药菌株。2011—2013年，美国难辨梭菌对万古霉素的耐药率为13.2%[11]，巴西和以色列难辨梭菌对万古霉素的耐药率分别为58.0%和31.5%[12-13]。本研究中，56株难辨梭菌对甲硝唑耐药的有6株（10.7%），未发现对万古霉素耐药菌株，但有6株难辨梭菌表现出对万古霉素耐药性下降的特征，其中2株对甲硝唑耐药的同时，对万古霉素的敏感性下降，提示难辨梭菌对2种临床首选抗菌药物的耐药性增高甚至耐药。

本研究结果显示，艰难梭菌对克林霉素的耐药率达到75.0%，对莫西沙星的耐药率为57.1%。克林霉素和莫西沙星双重耐药比例占耐药菌株的51.8%，三重耐药菌株占8.9%。难辨梭菌多重耐药模式的出现也说明其耐药形势严峻。有学者发现克林霉素的过量使用是A-B+菌株感染的独立危险因素[10]。本研究56例患者均未使用过克林霉素，但对克林霉素的耐药率却达75.0%。在没有药物选择性压力存在的情况下，是什么原因导致的细菌耐药需要进一步研究。本研究56例感染难辨梭菌的患者年龄为（76.1±14.3）岁，其中约77%的患者来自于老年科、消化科及呼吸科，提示免疫功能下降、高龄、患有严重基础疾病的患者易受难辨梭菌毒素攻击。

综上所述，航天中心医院难辨梭菌临床分离株耐药形势严峻，多重耐药模式多见，A+B+菌株和A-B+菌株感染患者的临床特征无差异。