19 号染色体开放阅读框5 蛋白调节自噬活性与结直肠癌恶性程度的关系△

李胜龙，闫炳文，王春敬，王明宇，乔鹏飞，王夫景#

1哈尔滨医科大学附属第二医院普通外科，哈尔滨150086

2哈尔滨医科大学附属第一医院普通外科，哈尔滨1500000

结直肠癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来中国结直肠癌的发病率和病死率均呈逐年升高的趋势，严重威胁着人们的健康。19 号染色体开放阅读框5（chromosome 19 open reading frame 5，C19ORF5）也称微管相关蛋白1S（microtubule associated protein 1S，MAP1S），是微管相关蛋白1 家族的一员，在细胞分裂中的功能已被证实，其在细胞分裂的起始阶段具有关键作用[1]。自噬现象是细胞通过溶酶体清除有缺陷的线粒体和蛋白质聚合体，从而维持线粒体自身稳定性，缓解内质网的应激状态[2]。自噬发生在真核细胞中，是细胞初级溶酶体处理内源性底物的重要过程，自噬功能障碍可诱导氧化应激，削弱有丝分裂检查点，引起DNA 双螺旋链裂解。这一系列的变化最终会导致遗传不稳定性的产生，是大多数实体瘤的起源。C19ORF5 是一种适配器蛋白，能够正向调控自噬活性，参与自噬溶酶体的产生和降解，从而影响基因的不稳定性和肿瘤的发生[3-7]。C19ORF5 升高时可激活自噬活性，抑制氧化应激反应和基因的不稳定性，而C19ORF5 缺乏时，自噬活性降低，基因不稳定性增加，易诱导肿瘤发生，因此认为C19ORF5 调节自噬活性与肿瘤病灶的恶性程度呈负相关[4]。因此，本研究探讨了C19ORF5 调节自噬活性与结直肠癌恶性程度的关系，旨在为结直肠癌化疗药物的开发、应用提供理论基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013 年5 月至2017 年5 月于哈尔滨医科大学附属第二医院接受治疗的结直肠癌患者。纳入标准：①经术后病理明确诊断为原发性结直肠癌；②术中完整切除肿瘤，病理证实切缘阴性；③术前无新辅助治疗，如化疗、放疗等；④临床资料、病理资料及随访资料完整。排除标准：①既往有肿瘤病史；②合并严重的心、脑、肺等基础疾病；③手术未达到R0切除。依据纳入和排除标准，本研究共纳入141 例结直肠癌患者。其中，男92 例，女49 例；年龄45～75 岁，中位年龄为63 岁；肿瘤类型：直肠癌94 例，升结肠癌14 例，横结肠癌7 例，降结肠癌5 例，乙状结肠癌21 例；TNM 分期：Ⅰ期6 例，Ⅱ期24例，Ⅲ期74例，Ⅳ期37例；病理类型：管状腺癌116 例，黏液腺癌20 例，未分化癌3 例，神经内分泌癌2例。收集结直肠癌患者的结直肠癌组织和癌旁正常组织（距结直肠癌组织≥5 cm）各141例。

1.2 检测方法

将结直肠癌组织和癌旁正常组织切分为3 个部分。第一部分观察组织中线粒体和溶酶体/自噬体超微结构的变化，首先应用枸橼酸钠洗涤3 次，2.5%的戊二醛固定，4 ℃冷藏3 h，然后制作成超薄切片并染色，在高压（80 kV）透射电镜下观察超微结构的变化。将第二部分组织置于4%多聚甲醛溶液中，将其固定、两次脱水处理、包埋，趁其未凝固，将组织蜡块切成5 μm 厚的薄片，切片贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，68 ℃烤片后，在显微镜下进行免疫组织化学染色。第三部分组织进行实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），采用实时定量PCR 试剂盒检测组织中C19ORF5 mRNA 的表达水平。

1.3 结果判定

细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。随机观察5 个高倍视野，采用半定量法进行评分。依据染色强度评分：无色为0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。依据阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞百分比﹤25%为1 分，25%～75%为2 分，﹥75%为3 分。染色强度评分与阳性细胞百分比评分相加，0～3 分为低表达，4～6 分为高表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁正常组织中C19ORF5蛋白表达情况的比较

电镜下观察组织的超微结构，尤其是亚细胞器官（线粒体和溶酶体/自噬体）的结构。结果显示，Ⅰ/Ⅱ期结直肠癌细胞的自噬活性较高，Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌细胞的自噬活性较低。免疫组织化学染色结果显示，C19ORF5 蛋白为淡黄色至棕褐色颗粒，表达于细胞质。结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白的染色强度明显高于癌旁正常组织，Ⅰ/Ⅱ期结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白的染色强度明显高于Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌组织（图1）。

2.2 结直肠癌组织和癌旁正常组织中C19ORF5 mRNA 表达水平的比较

结直肠癌组织中C19ORF5 mRNA 的表达水平为（1.17±0.45），明显高于癌旁正常组织的（0.82±0.29），差异有统计学意义（t=3.217，P=0.004）。

2.3 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白表达情况的比较

结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白低表达97 例，C19ORF5 蛋白高表达44 例。TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）升高、无肝转移结直肠癌患者结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白高表达率分别高于TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝转移的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。不同淋巴结转移情况结直肠癌患者结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白表达情况比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

图1 C19ORF5蛋白在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

3 讨论

结直肠癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，据报道，全球每年新增结直肠癌患者102万例，死亡53 万例[8]。手术或联合放化疗可改善结直肠癌患者的预后，但远期生存情况的改善不明显。随着基础研究的不断发展，靶向治疗及免疫治疗已逐渐成为恶性肿瘤辅助治疗的重要方法，研究与发现新的结直肠癌标志物对改善临床治疗效果、延长患者的生存时间具有重要意义。C19ORF5 是作用于自噬过程的一种适配器蛋白，能够正向调控自噬活性，并参与自噬溶酶体的产生和降解[9-10]。自噬功能障碍可诱导氧化应激，氧化应激可削弱有丝分裂检查点，引起DNA 双螺旋链裂解。这一系列的变化最终会导致遗传不稳定性的增加，是大多数实体瘤的起源，并对肿瘤的发生发展具有调节作用，已成为研究热点[11]。

本研究结果显示，Ⅰ/Ⅱ期结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白的染色强度明显高于Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌组织，说明C19ORF5 蛋白在早期结直肠癌组织中高表达，自噬过程较为活跃，在晚期结直肠癌组织中表达降低，自噬活性降低。研究发现，C19ORF5 蛋白可增强自噬作用，其与氧化应激和基因不稳定性之间具有重要关联[4]。高水平的氧化应激和基因的不稳定性均能够增强C19ORF5 蛋白的表达，而C19ORF5 蛋白可激活自噬作用，去除p62（一种反映细胞氧化应激强度的自噬底物蛋白）相关的聚合体与失去功能的细胞器，从而抑制氧化应激过程，减少DNA 双螺旋的裂解，并抑制基因的不稳定性。由于存在着这样的反馈环路，机体才能够保持平衡和稳定的发展。一旦C19ORF5蛋白表达缺失，自噬活性将受到影响，反馈环路被打破，基因的不稳定性将会增加[4,12-13]。因此，C19ORF5 蛋白增强自噬作用与抑制基因的不稳定性和肿瘤发生的关系得以建立。

表1 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白表达情况的比较（n=141）

本研究的实时定量PCR 结果显示，结直肠癌组织中C19ORF5 mRNA 的表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P﹤0.01）；TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、CEA 升高、无肝转移结直肠癌患者结直肠癌组织中C19ORF5 蛋白高表达率分别高于TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝转移的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。说明结直肠癌组织中C19ORF5 mRNA 表达水平升高，且其蛋白表达情况与TNM 分期、CEA 水平、肝转移有关。有研究显示，C19ORF5 蛋白主要表达于复层上皮细胞的细胞质中，随着肿瘤细胞的增殖，表达C19ORF5 蛋白的细胞数量增多[11,14]。肿瘤发生后，为满足机体对自噬活性的需求，C19ORF5 蛋白会在肿瘤生发中心表达上调，但如果C19ORF5 蛋白在肿瘤细胞中缺失，自噬活性将降低，低表达C19ORF5 蛋白的患者生存率降低，且患者易出现淋巴结和肝转移等[15]。

综上所述，在结直肠癌组织中，高表达的C19ORF5 蛋白可增加肿瘤细胞的自噬活性，增加基因的稳定性，降低肿瘤的恶性程度。因此推测，由于C19ORF5 蛋白调节自噬活性与结直肠癌的恶性程度呈负相关，C19ORF5 可能是一种重要的抑癌基因，C19ORF5 蛋白缺失或基因变异可能是导致肿瘤进一步恶化的关键因素。针对C19ORF5 蛋白的深入研究可以为结直肠癌的诊断和治疗提供新的思路。