山竹果皮总氧杂蒽酮通过调控肝癌扩增因子1 表达抑制结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡

陈素华，马天江，张智慧，张磊，史磊

漯河市中心医院肿瘤科，河南 漯河4620000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率分别居恶性肿瘤第3位和第4位，普遍呈上升趋势[1]。据统计，美国平均每年约有40.7/10 万CRC 新发病例，死亡14.8/10 万例，其中男性发病率和病死率分别高于女性30%和40%[2]。吸烟、酗酒、暴饮暴食、肠道菌群稳态失衡、家族遗传等是结直肠癌的危险因素，但其发病机制尚未详细阐明[3-4]。结直肠癌的临床治疗以腹腔镜手术、开腹手术等外科手术治疗为主，辅以放疗、化疗、分子靶向治疗等，术后总5 年生存率约为50%[5]；但多数患者术后易复发转移，且多数患者就诊时已为晚期，放、化疗对患者造成的负担较大，因此寻找高效低毒的天然化合物辅助治疗是目前肿瘤领域研究的热点之一[6]。山竹（Garcinia mangostana L）为金丝桃科藤黄属常绿乔木，俗称山竹子、山竺，主要分布于泰国、马来西亚等国家及中国海南、广西、福建等地；在一些东南亚国家，山竹果皮常用于治疗痢疾、溃疡和外伤等[7]。氧杂蒽酮类化合物（xanthones）是山竹果皮的主要化学成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等广泛的药理活性[8]。肝癌扩增因子1（amplified in liver cancer 1，ALC1）又称为染色质解旋酶DNA 结 合 蛋 白1（chromodomain helicase DNA binding protein 1 like，CHD1L），是从人肝癌细胞克隆并分离的新的癌基因，位于染色体1q21 区[9-10]。ALC1 可编码89 kD 分子的蛋白，包含一个SNF2-N结构域，属于SNF2 类家族；能够与DNA 结合调节核小体组装、DNA 修复和染色质重塑[11-12]。ALC1在食管癌、乳腺癌等肿瘤组织中高表达，其表达水平与肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤分期及患者预后具有显著相关性，敲除ALC1 后，细胞迁移和侵袭能力均明显降低[13-14]。ALC1 在结直肠癌组织中明显高表达，参与结直肠癌的发生发展[15]。但氧杂蒽酮对结直肠癌进展的影响及其是否通过ALC1 影响结直肠癌的增殖和凋亡还尚未清楚。本研究通过以不同浓度氧杂蒽酮干预SW480 细胞，检测细胞增殖、凋亡及ALC1 表达，探讨氧杂蒽酮对SW480 细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制，以期为结直肠癌的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

SW480 细胞购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、RPMI1640 培养液均购自美国Gibco-BRL 公司；胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher 公司；5-二苯基四氮 唑 溴 盐（5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均购自美国Sigma 公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）凋亡检测试剂盒购自美国Coulter 公司；Lipofectamine 2000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司；control siRNA、ALC1 siRNA 由山东维真生物科技有限公司设计合成；pcDNA-ALC1 过表达载体由金瑞斯生物科技公司构建；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、电 化 学 发 光（electrochemiluminescence，ECL）液、Trizol 试剂、RIPA 裂解液均购自北京Solarbio 公司；兔抗B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcell lymphoma/leukemia- 2 associated X protein，BAX）、ALC1、β-actin 抗 体 和 辣 根 过 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均购自美国Abcam 公司；TaKaRa 反转录试剂盒、TaKaRa 实时荧光定量试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。CFX96 Touch TM 荧光定量PCR 检测系统、Chemi-Doc TM MP 凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad 公司；MCO-18AC 型CO2培养箱购自日本SANYO 公司；Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白测定仪购自上海创萌生物科技有限公司；HBS-1096B 型酶标仪购自南京德铁实验设备公司。

1.2 山竹果皮中总氧杂蒽酮提取物的制备

将山竹果皮洗净烘干后粉碎，取50 g 山竹果皮粉末溶于500 ml 85%乙醇中，放置过夜（16 h）；过滤收集上清液，旋蒸至约10 ml，用乙酸乙酯萃取，取上清；过硅胶柱后正己烷和乙酸乙酯（5∶1）洗脱，洗脱液烘干后所得干粉用DMSO 溶解，-20 ℃保存备用。

1.3 细胞培养与转染

使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养SW480 细胞。取对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后收集并重悬，调整细胞悬液浓度为1×105/ml，接种至24 孔板，继续培养至细胞融合度约45%，将control siRNA（si-NC 组）、ALC1 siRNA（si-ALC1 组）、pcDNA3.1 空载体和pcDNA-ALC1 过表达载体转染至SW480 细胞，转染pcDNA3.1 空载体和pcDNAALC1 过表达载体的细胞置于含400 μmol/L 山竹果皮总氧杂蒽酮的培养液中培养并记为总氧杂蒽酮+pcDNA 组和总氧杂蒽酮+pcDNA-ALC1 组。单独使用含400 μmol/L 山竹果皮总氧杂蒽酮的培养液常规培养的细胞记为总氧杂蒽酮组，未作处理的细胞记为对照组。每组6个复孔，实验重复3次。

1.4 MTT 法检测细胞增殖

取SW480细胞随机分为0 μmol/L组、200 μmol/L组、400 μmol/L 组、600 μmol/L 组和800 μmol/L 组；处理方法：在SW480 细胞培养液中加入总氧杂蒽酮，并分别调整终浓度为0、200、400、600、800 μmol/L，继续培养48 h。在上述细胞及si-NC组、si-ALC1组、对照组、总氧杂蒽酮组、总氧杂蒽酮+pcDNA组和总氧杂蒽酮+pcDNA-ALC1组细胞培养液中加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl 二甲基亚砜振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm 处吸光度（A）值。药物对细胞的抑制率=（1-实验组A 值/对照组A 值）×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

取si-NC 组、si-ALC1 组、对照组、总氧杂蒽酮组、总氧杂蒽酮+pcDNA 组和总氧杂蒽酮+pcDNAALC1组细胞，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃、1600 r/min离心收集。按照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书，分别加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，轻轻混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测mRNA 相对表达量

收集对照组、总氧杂蒽酮组细胞，研磨充分后Trizol 法提取总RNA。检测总RNA 浓度和纯度，按照TaKaRa 反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，使用TaKaRa 荧光定量试剂盒配制反应体系，以β-actin 为内参进行PCR 扩增，每个RNA 样品重复3 次。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量，所用引物及序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物及序列

1.7 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达情况

收集si-NC 组、si-ALC1 组、对照组、总氧杂蒽酮组、总氧杂蒽酮+pcDNA 组和总氧杂蒽酮+pcDNA-ALC1 组细胞，加入RIPA 裂解液置于冰上裂解细胞，4 ℃、23 000 r/min 离心15 min，收集上清液。将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳后转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入兔抗Bcl-2（1∶1000）、BAX（1∶1000）、ALC1（1∶1000）和β-actin（1∶10 000）抗体4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，每次10 min；加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5000）室温孵育2 h，TBST 洗涤；ECL 发光显影，每个蛋白样品重复3 次。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q 检验，两组间比较采用t 检验，以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度总氧杂蒽酮对SW480细胞增殖的影响

MTT 检测结果表明，不同浓度山竹果皮总氧杂蒽酮均可有效抑制SW480 细胞增殖（P﹤0.05），其增殖抑制率随总氧杂蒽酮浓度的增加而提高（P﹤0.05）；400 μmol/L 总氧杂蒽酮处理后细胞增殖抑制率接近50%，用于后续实验。（表2）

表2 不同浓度总氧杂蒽酮对SW480 细胞增殖抑制率的比较（±s）

表2 不同浓度总氧杂蒽酮对SW480 细胞增殖抑制率的比较（±s）

注：a与0 μmol/L组比较，P<0.05；b与200 μmol/L组比较，P<0.05；c与400 μmol/L组比较，P<0.05；d与600 μmol/L组比较，P<0.05

组别0 μmol/L组200 μmol/L组400 μmol/L组600 μmol/L组800 μmol/L组F值P值增殖抑制率（%）5.6±0.76 23.12±2.13a 48.46±4.11a b 63.74±5.11a b c 78.49±5.04a b c d 179.011 0.000

2.2 总氧杂蒽酮对SW480 细胞凋亡的影响

以400 μmol/L 总氧杂蒽酮干预SW480 细胞，凋亡细胞增多，细胞凋亡率为（25.79±2.11）%，高于对照组的（7.61±0.69）%，差异有统计学意义（t=14.184，P﹤0.05）。（图1）

图1 流式细胞仪检测对照组与总氧杂蒽酮组细胞凋亡情况

2.3 总氧杂蒽酮对SW480 细胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相对表达量的影响

以400 μmol/L 总氧杂蒽酮干预SW480 细胞后检测细胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相对表达量。总氧杂蒽酮组SW480 细胞中Bcl-2、ALC1 相对表达量均明显低于对照组，BAX 相对表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表3）

表3 对照组与总氧杂蒽酮组SW480 细胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相对表达量的比较（±s）

表3 对照组与总氧杂蒽酮组SW480 细胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相对表达量的比较（±s）

组别对照组总氧杂蒽酮组t值P值Bcl-2 mRNA 0.97±0.08 0.58±0.05 7.160 0.002 BAX mRNA 0.66±0.07 1.03±0.06 6.951 0.002 ALC1 mRNA 5.61±0.12 2.97±0.15 23.804 0.000

2.4 总氧杂蒽酮对SW480 细胞中Bcl-2、BAX、ALC1 蛋白表达情况的影响

Western blot 实验结果显示，总氧杂蒽酮组SW480 细胞中Bcl-2、ALC1 蛋白表达量均明显低于对照组，BAX 蛋白表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（图2、表4）

2.5 敲减ALC1 对SW480 细胞增殖和凋亡的影响

si-ALC1 组SW480 细胞中ALC1 蛋白表达水平明显低于si-NC 组，细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于si-NC 组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（图3、表5）

图2 Western blot法检测对照组及总氧杂蒽酮组SW480细胞中Bcl-2、BAX、ALC1蛋白表达情况

表4 对照组与总氧杂蒽酮组SW480 细胞中Bcl-2、BAX、

ALC1 蛋白表达量的比较（±s）

组别对照组总氧杂蒽酮组t值P值Bcl-2蛋白0.53±0.03 0.19±0.02 16.333 0.000 BAX蛋白0.16±0.02 0.47±0.04 12.006 0.000 ALC1蛋白0.86±0.07 0.37±0.04 10.527 0.001

图3 Western blot检测si-NC组和si-ALC1组SW480细胞中ALC1蛋白表达情况

表5 si-NC 组和si-ALC1 组SW480 细胞ALC1 蛋白表达量、增殖抑制率及凋亡率的比较（±s）

表5 si-NC 组和si-ALC1 组SW480 细胞ALC1 蛋白表达量、增殖抑制率及凋亡率的比较（±s）

组别si-NC组si-ALC1组t值P值ALC1蛋白0.79±0.08 0.25±0.03 10.947 0.000增殖抑制率（%）6.46±0.67 39.49±3.17 17.657 0.000凋亡率（%）7.13±0.72 21.46±2.24 10.549 0.001

2.6 过表达ALC1 对SW480 细胞增殖和凋亡的影响

总氧杂蒽酮组SW480 细胞中ALC1 蛋白表达水平低于对照组，细胞增殖抑制率和凋亡率均高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）；而将pcDNA-ALC1 转染至SW480 细胞进行预处理后，总氧杂蒽酮+pcDNA-ALC1 组SW480 细胞中ALC1蛋白表达水平高于总氧杂蒽酮+pcDNA 组，细胞增殖抑制率和凋亡率均低于总氧杂蒽酮+pcDNA 组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（图4、表6）

图4 Western blot检测各组SW480细胞中ALC1蛋白表达情况

表6 各组SW480 细胞ALC1 蛋白表达量、增殖抑制率及凋亡率的比较（±s）

表6 各组SW480 细胞ALC1 蛋白表达量、增殖抑制率及凋亡率的比较（±s）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与总氧杂蒽酮+pcDNA组比较，P<0.05

增殖抑制率（%）7.11±0.68 49.36±4.07a 46.11±4.34 12.76±2.13b 143.573 0.000凋亡率（%）7.98±0.81 28.46±2.11a 24.13±2.09 14.26±1.87b 79.972 0.000组别对照组总氧杂蒽酮组总氧杂蒽酮+pcDNA组总氧杂蒽酮+pcDNA-ALC1组F值P值ALC1蛋白0.82±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.02 0.73±0.07b 84.649 0.000

3 讨论

随着生活方式和饮食结构的改变及人口老龄化的加剧，中国结直肠癌发病率和病死率逐年增高，在2003—2011 年，中国结直肠癌发病率由12.8/10 万增加到16.8/10 万，病死率则由5.9/10 万上升至7.8/10 万，严重影响居民生活质量[16]。因此，寻找结直肠癌早期预防及改善其临床疗效的有效方法具有重要意义。

山竹是一种药食同源的水果，其果实富含维生素、蛋白质和矿物质，食用价值较高，素有“水果王后”之称；其果皮、树皮及树根是泰国、印度等国家的传统药材，对腹泻、腹痛、跌打扭伤、伤口感染的治疗效果显著[17]。氧杂蒽酮类化合物、黄酮类化合物是山竹果皮的主要活性成分，其中，氧杂蒽酮能够抑制乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤的细胞活力，并对细胞凋亡具有促进作用[18]。多项研究表明，氧杂蒽酮能够通过调节丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导途径、半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）信号通路及p38、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等基因表达，抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡，减少炎性介质的释放，从而发挥肿瘤抑制作用[19-20]。caspase 3是caspase 级联反应过程中的关键执行分子，而Bcl-2 和BAX 位于线粒体上游，当出现凋亡信号刺激时，BAX 由细胞质转移至线粒体膜上与Bcl-2 结合形成同源二聚体，同时改变线粒体膜通透性，促进细胞色素C 的释放，进而激活caspase 3，启动caspase 级联反应[21]。而氧杂蒽酮能够使多种肿瘤细胞周期停滞，同时促进细胞凋亡[22]。为研究氧杂蒽酮对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及潜在作用机制，本研究以SW480 细胞为研究对象，使用不同浓度氧杂蒽酮干预细胞发现，细胞增殖抑制率浓度依赖性增大；400 μmol/L 氧杂蒽酮可有效促进SW480 细胞凋亡，抑制Bcl-2 表达并上调BAX表达。

李杨等[23]研究发现，ALC1 在肝癌细胞系中表达上调，采用RNAi 技术沉默ALC1 表达后，细胞增殖能力明显受到抑制。ALC1 高表达与食管鳞状细胞癌的发生、发展相关，ALC1 高表达的食管鳞状细胞癌患者总生存率低；ALC1 高表达可增强KYSE30 食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力[13]。而在结直肠癌中，已有报道称，ALC1 蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，且ALC1 表达水平与肿瘤浸润深度、肿瘤大小及分化程度密切相关，上调ALC1 表达能促进结直肠癌细胞增殖、迁移及裸鼠成瘤能力[15]。为研究氧杂蒽酮调控SW480 细胞增殖和凋亡的作用是否与ALC1 有关，本研究以400 μmol/L 氧杂蒽酮处理SW480 细胞后发现，细胞中的ALC1 mRNA 和蛋白表达水平均显著下调。提示氧杂蒽酮对SW480 细胞增殖、凋亡的影响可能与ALC1 的低表达有关。为验证这一猜想，进一步检测发现，采用RNAi 技术敲减ALC1 表达后，SW480 细胞增殖抑制率和凋亡率均明显升高，而过表达ALC1 后氧杂蒽酮对SW480 细胞的增殖抑制和凋亡促进作用均有所减弱。氧杂蒽酮通过抑制Bcl-2 表达并上调BAX 表达而调控SW480 细胞凋亡，且氧杂蒽酮处理会使ALC1 表达下降，敲减ALC1 也能促进细胞凋亡，提示氧杂蒽酮可能通过抑制ALC1、Bcl-2 表达，上调BAX 表达进而影响SW480 细胞的增殖和凋亡。

综上所述，氧杂蒽酮可有效抑制SW480 人结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡，这一结果可能是通过抑制ALC1 表达完成，有望为结直肠癌的预防及治疗提供新思路。