百里香挥发油及其主成分的生物活性研究

2020-10-16张露云夏广清于俊林

通化师范学院学报 2020年10期

臧皓，张露云，于帅，徐倩，夏广清，于俊林

1 仪器与材料

美国Thermo Fisher Trace 1300-ISQ GC-MS联用仪；ZNHW-2 型智能控温仪（巩义市宇翔仪器有限公司）；Sartorius QUINTIX35-1CN 电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；百里酚、β-石竹烯、3-甲基-4-异丙基酚和γ-萜品烯均购自萨恩化学试剂公司，实验中所用试剂及溶剂均为分析纯.

大肠杆菌（Escherichia coliATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC29213）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC19111）由通化师范学院微生物研究室提供.百里香采于吉林省龙井市，由通化师范学院医药学院于俊林教授鉴定为百里香.

2 方法

2.1 挥发油的提取

将新鲜百里香切碎，称取600 g，加5 倍量水浸泡，用水蒸气蒸馏法提取4 h，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥后4 ℃下保存，备用.

2.2 色谱条件

SE-54 石英毛细管柱（0.25 mm × 30 m，0.25 μm）；进样口温度250 ℃.程序升温：初始温度50 ℃，以5 ℃·min-1的速度均匀升至200 ℃，再以1 ℃·min-1的速度均匀升至220 ℃.载气为高纯氦气，流速1 mL·min-1，进样量1.0 μL，分流比10∶1.

2.3 质谱条件

离子源温度230 ℃；色谱-质谱接口温度280 ℃；电离源（EI）；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；扫描质量范围（m/z）50～500；扫描周期0.2 s.

2.4 抑菌活性研究

按文献［2］的方法测定挥发油及其主成分的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），氯霉素和链霉素作为阳性对照.

2.5 DPPH 实验

在96 孔板中先加入100 μL 50 μmol·L-1DPPH 甲醇溶液，再加入100 μL 不同浓度样品的甲醇溶液，混合后在暗处孵化20 min，在492 nm 下测定吸光值，计算IC50值.维生素C和Trolox 用作阳性对照［3］.

根据以上交流中出现的问题，作者重点观察和收集学生在遇到这三种突出问题时所采取的反应和方法，并根据Dornyei和Scott(1997)的交际策略分类，总结出学生经常使用的7种交际策略。

2.6 ABTS 实验

在96 孔板中先加入190 μL ABTS·+溶液，再加入10 μL 不同浓度样品的DMSO 溶液.混合后在暗处孵化20 min，在734 nm 下测定吸光值，计算IC50值.维生素C 和Trolox 用作阳性对照［4］.

2.7 乙酰胆碱酯酶（AChE）实验

在96 孔板中先加入20 μL 不同浓度样品的10% DMSO 溶液，再加入120 μL 磷酸盐缓冲液（pH8.0，0.1 mol·L-1）和20 μL 0.8 U·mL-1AChE 磷酸盐溶液，混合后在25 ℃下孵化15 min.再依次加入20 μL 1.78 mmol·L-1碘代硫代乙酰胆碱磷酸盐溶液和20 μL 1.25 mmol·L-15，5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）磷酸盐溶液，在25 ℃孵化5 min，孵化前后分别在405 nm 下测定吸光值，计算IC50值.上述实验均重复3 次，多奈哌齐用作阳性对照［5］.

2.8 丁酰胆碱酯酶（BChE）实验

在96 孔板中先加入20 μL 不同浓度样品的10% DMSO 溶液，再加入120 μL 磷酸盐缓冲液（pH8.0，0.1 mol·L-1）和20 μL 0.8 U·mL-1BChE 磷酸盐溶液，混合后在25 ℃下孵化15 min.再依次加入20 μL 氯化-S-丁酰硫代胆碱磷酸盐溶液和20 μL 1.25 mmol·L-1DTNB 磷酸盐溶液，在25 ℃孵化5 min，孵化前后分别在405 nm下测定吸光值，计算IC50值，多奈哌齐用作阳性对照［5］.

2.9 α-葡萄糖苷酶实验

在96 孔板中先加入20 μL 不同浓度样品的DMSO 溶液，再加入100 μL 0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶磷酸盐溶液（pH6.9，0.1 mol·L-1），混合后在25 ℃下孵化10 min. 再加入50 μL 5 mmol·L-1对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷磷酸盐溶液，在25 ℃孵化5 min，孵化前后分别在405 nm 下测定吸光值，计算IC50值.阿卡波糖用作阳性对照［6］.

2.10 分子模拟研究

使用软件Discovery Studio Client 2017 进行分子对接研究，将3-甲基-4-异丙基酚、β-石竹烯、百里酚和γ-萜品烯对接到α-葡萄糖苷酶模型中，以阿卡波糖作为阳性对照研究它们的结合模式，最佳结合位点用模拟得分进行判断［6］.

2.11 统计学处理

上述实验均重复3 次，采用SPSS 22.0 和Origin 8.0 等软件对所获得的数据进行统计分析与处理.

3 结果

3.1 挥发油提取率

经水蒸气蒸馏法提取，百里香挥发油得率为0.4%.

3.2 挥发油成分分析

图1 百里香挥发油的离子流图

表1 百里香挥发油的化学成分

根据GC-MS 色谱条件对百里香的化学成分进行分析，得其总离子流图，见图1.对挥发油总离子流图中的各色谱峰进行质谱扫描后，通过检索比对图谱库NIST，应用Xcalibur软件数据处理系统计算各色谱峰的峰面积，见表1.鉴定出挥发性成分19 种，占挥发油总量的97.1%，主要成分为百里酚（32.3%）、γ-萜品烯（22.1%）、龙脑（12.0%）、邻伞花烃（11.6%）、β-石竹烯（3.8%）、3-甲基-4-异丙基酚（3.7%）.

3.3 抑菌活性测定

百里香挥发油及其四种主成分均具有抑菌活性，其中百里酚、β-石竹烯和γ-萜品烯的抑菌活性最好，强于挥发油，实验结果见表2.

表2 百里香挥发油及其主成分的抑菌活性

3.4 抗氧化活性测定

百里香挥发油及其四种主成分均具有抗氧化活性，挥发油对DPPH 和ABTS 的IC50值分别为353.2 mg·L-1和7.2 mg·L-1，β-石竹烯和γ-萜品烯没有显示出任何抗氧化能力.DPPH自由基清除活性为维生素C>Trolox>百里酚>挥发油>3-甲基-4-异丙基酚.3-甲基-4-异丙基酚在ABTS 测定中具有最高的清除活性，其次是百里酚、维生素C、Trolox 和挥发油.实验结果见表3.

表3 百里香挥发油及其主成分的抗氧化活性

3.5 抗胆碱酯酶活性测定

与多奈哌齐相比，挥发油具有较弱的抗AChE（113.6 mg·L-1）和抗BChE（208.0 mg·L-1）活性，β-石竹烯具有一定的抑制活性（AChE为7.2 mg·L-1，BChE 为20.8 mg·L-1），其他主要成分均表现出弱的抗胆碱酯酶活性.实验结果见表4.

表4 百里香挥发油及其主成分的酶抑制活性

3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定及分子模拟研究

百里香挥发油及其四种主成分均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中挥发油（93.3 mg·L-1）、β-石竹烯（65.8 mg·L-1）和3-甲基-4-异丙基酚（64.6 mg·L-1）的活性较高，接近但仍高于阳性对照阿卡波糖（39.3 mg·L-1）.

分子模拟结果显示，最活泼的化合物β-石竹烯的自由结合能为-5.89 kcal·mol-1，低于阿卡波糖（-5.67 kcal·mol-1），然后是百里酚（-4.59 kcal·mol-1），3- 甲基-4- 异丙基酚（-4.35 kcal·mol-1）和γ-萜品烯（-3.89 kcal·mol-1）.

4 讨论

李运等［7］对甘肃三个区域产的百里香挥发油的主成分进行研究发现，达宗湖产百里香的主成分为香叶醇（34.17%）、百里酚（15.39%）和长叶烯（5.60%）；扎油沟产百里香的以芳樟醇（40.73%）和百里酚（3.17%）为主；天水产百里香的主成分为百里酚（14.60%）、侧柏烯（4.30%）、雪松醇（2.49%）和桉叶醇（2.38%）.陈耀祖等［8］报道，百里香挥发油的主成分是牻牛儿醇（26.95%）、香荆芥酚（18.40%）和百里酚（17.72%）.由于同种植物挥发油的成分会受到品种、气候、地域、采集分析条件等因素的影响，导致虽然本实验与文献报道的百里香挥发油的主成分都含有百里酚，但其他成分与前人的研究结果不同.

百里香的抗菌活性可能来自其主成分百里酚、β-石竹烯和γ-萜品烯，这些主成分是已知的抗菌剂［9-11］，也可能是它们之间的协同效应和挥发油中微量成分在发挥作用.

百里香挥发油的高ABTS 清除活性可能归因于百里酚和3-甲基-4-异丙基酚的作用.实验结果也显示，百里酚的DPPH 清除活性高于挥发油.对挥发油弱的清除能力的一个解释是其某些主成分和其他成分可能对清除活性起拮抗作用，一些研究报告也证实了这一点［12-13］.

百里香挥发油的抗胆碱酯酶活性可能源于β-石竹烯和γ-萜品烯的作用.POLITEO 等研究发现石竹烯具有高AChE 抑制活性［14］；OKONOGI 等报道γ-萜品烯也显示出优异的抗胆碱酯酶活性［15］.同时挥发性成分的分子量通常较小，容易透过血脑屏障［16］.

α-葡萄糖苷酶将二糖水解为葡萄糖，因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂具有降糖作用.据我们所知，目前没有关于百里香挥发油α-葡糖苷酶抑制活性的报道.实验结果显示，3-甲基-4-异丙基酚和β-石竹烯具有降糖活性，这与文献报道一致［17］.百里酚显示出弱的抑制活性，但有报道对π 型糖尿病具有治疗作用［18］，这表明百里酚不是通过抑制α-葡萄糖苷酶达到降糖作用.对百里香挥发油主成分进行分子模拟研究，解释了挥发油的高抑制活性，也说明百里香挥发油有作为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力.