miR-21和PTEN在肺癌脑转移患者血清中的表达及其与临床病理特征和预后的关系*

楼建, 周月芬, 王永辉, 吴敏华, 黄剑辉

丽水市中心医院肿瘤内科(浙江丽水 323020)

肺癌是发病率、病死率增长速度最快、对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一，具有进展迅速、侵袭性强、早期转移等特点，同时也是原发恶性肿瘤中最易发生转移的肿瘤[1-2]，研究表明肺癌脑转移发生率约为40%，是最常见脑转移性肿瘤[3]。肺癌脑转移后病情进展加快，患者预后普遍较差[4]。因此，探究肺癌脑转移的发病机制，对诊断和治疗有重要的意义。微小RNA(miRNA)在肺癌脑转移过程中发挥作用，研究表明miR-21可通过激活STAT3通路调控肺源性脑转移细胞容量[5]，提示miR-21可能与肺癌脑转移有关，但有关miR-21与肺癌脑转移的研究未见报道。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是具有磷脂酶活性的抑癌基因，最近研究发现miR-92a可调控PTEN /PI3K/AKT信号通路促进肺癌上皮间质转化[6]，提示PTEN可能与肺癌癌细胞转移有关。本研究旨在探究miR-21、PTEN在肺癌脑转移患者血清中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2014年2月至2015年8月于本院就诊的238例经病理确诊的肺癌患者为研究对象，均为 Ⅳ期，脑CT和核磁共振成像脑转移阳性患者纳入肺癌脑转移组，脑CT和核磁共振成像脑转移阴性患者纳入肺癌非脑转移组，肺癌脑转移组患者均行脑肿瘤全切除术治疗，其中肺癌全切手术52例，肺癌部分切除术26例，单纯放疗12例，单纯化疗18例，其余均行放化疗联合治疗。肺癌非脑转移组患者中137例为肺癌全切术，23例为部分切除术。单纯放疗42例，单纯化疗57例，其余均行放化疗联合治疗。肺癌脑转移组患者78例，男40例，女38例，年龄46～78岁，平均(61.42±12.47)岁，病理分型：肺腺癌34例，肺鳞癌44例；单纯脑转移32例，脑转移合并其他远处转移46例；肺癌非脑转移组160例，男89例，女71例，年龄45～77岁，平均(60.97±12.47)岁，病理分型：肺腺癌72例，肺鳞癌88例。两组患者年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：(1)所有肺癌患者符合《中国原发性肺癌诊疗规范》诊断标准[7]并经病理确诊为肺癌患者；(2)肺癌脑转移组患者经脑CT和MRI诊断确诊；(3)患者依从性好，能配合完成临床资料调查和随访；(4)临床资料完整；(5)患者及家属知情同意并自愿参与。

排除标准：(1)合并免疫性疾病患者；(2)合并其他恶性肿瘤者；(3)肝肾功能不全者；(4)半年内有重大外伤或有外科手术史者；(5)危重症或预计生存时间<3个月者。

1.3 方法

1.3.1 血清miR-21表达水平检测 取患者入院清晨空腹静脉血5 mL于离心管，4℃、2 000 r/min离心10 min，取上层血清备用。血清miR-21表达水平采用实时荧光定量PCR法测定：取部分血清用于提取血清总RNA。总RNA提取采用Trizol试剂盒(索莱宝公司)法，提取后琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度及完整性。取2 μg无降解高纯度总RNA，以定量反转录试剂盒(TaKaRa公司)反转录为cDNA，参照荧光定量PCR试剂盒SYBR Green PCR master mix(大连宝生物公司)说明加配反应体系，每个样本重复3次；体系加配完成后放入荧光定量PCR仪(Bio-rad cfx manager，Bio-rad公司)。反应结束后收集实验数据，miR-21以U6为内参基因(引物序列详见表1)，采用2-ΔΔCt算法计算两组患者血清miR-21相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 血清miR-21、PTEN表达水平检测 血清PTEN蛋白表达水平采用酶联免疫吸附法测定：取两组患者血清，采用酶联免疫吸附试剂盒(美国R&D公司生产)测定，试验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 随访 通过复诊或电话等方式对入组患者进行随访，随访时间为6～36个月，平均(18.67±3.58) 个月，随访截止日期为2018年9月1日。总生存期(overall survival，OS)即从随机化分组开始,至因任何原因引起死亡的时间。所有患者均配合完成随访，无一例失访，随访率100%。

1.5 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件，计数资料以例(%)描述，两组间比较行2检验，符合正态分布的计量资料以描述，两组间比较行独立样本t检验，Kaplan-Meier分析肺癌脑转移患者3年的生存情况，COX回归分析影响肺癌脑转移患者预后的危险因素，Pearson分析血清miR-21与PTEN表达水平相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清miR-21、PTEN表达水平比较 肺癌脑转移组患者血清miR-21表达水平显著高于肺癌非脑转移组(P<0.05)；肺癌脑转移组患者血清PTEN蛋白表达水平显著低于肺癌非脑转移组(P<0.05)。见表2。

项目肺癌非脑转移组(n=160)肺癌脑转移组(n=78)t值P值miR-21/U61.03±0.151.59±0.2621.0210.000PTEN (ng/mL)4.27±1.262.48±0.5711.9550.000

2.2 血清miR-21、PTEN表达水平与肺癌脑转移患者临床病理特征的关系 根据肺癌脑转移组患者血清miR-21表达水平、PTEN蛋白水平平均值，将患者分为miR-21低表达组30例(低于平均值)、miR-21高表达组48例(高于平均值),PTEN低表达组46例,PTEN高表达组32例。结果显示miR-21、PTEN表达水平与肺癌脑转移组患者组织分化程度、脑转移病灶数有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、病理类型、肿瘤大小无关(P>0.05)。见表3。

2.3 血清miR-21、PTEN表达水平与肺癌脑转移患者预后的关系 miR-21低表达患者3年总生存率为46.67(14/30)，显著高于miR-21高表达患者的20.83%(10/48)；PTEN高表达患者总生存率为50.0%(16/32)，显著高于PTEN低表达患者的17.39(8/46)。见图1。

表3 血清miR-21、PTEN表达水平与肺癌脑转移患者临床病理特征的关系 例(%)

2.4 影响肺癌脑转移患者预后的危险因素分析 COX单因素分析显示miR-21、PTEN表达水平、分化程度是影响肺癌脑转移患者预后的危险因素，多因素分析结果显示miR-21、PTEN表达水平、组织分化程度是影响肺癌脑转移患者不良预后的独立危险因素。见表4。

2.5 肺癌脑转移患者血清miR-21表达水平与PTEN 蛋白水平相关性分析 Pearson相关性分析结果显示miR-21和PTEN表达水平呈负相关(r=-0.701，P=0.000)，见图2。

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是易发生远处转移的恶性肿瘤之一。脑部是肺癌发生转移的主要器官，研究表明，肺癌患者在疾病进展过程中发生脑转移率为20%～65%，且预后普遍较差[8]。近年来，生存环境的恶化、工作生活压力增加，使肺癌发病率逐年升高，肺癌脑转移患者的发病率也逐渐升高，治疗手段的不断发展，部分肺癌脑转移患者生存时间延长[9]，但患者生活质量和预后并未显著改善。miRNA在肺癌等多种恶性肿瘤细胞增殖、转移

A：miR-21;B:PTEN

表4 COX分析影响肺癌脑转移患者预后的危险因素

图2肺癌脑转移患者血清miR-21表达水平与PTEN蛋白水平水平相关性分析

过程中发挥着重要作用，可通过与靶基因发生特异度结合调控靶基因表达，参与肿瘤细胞增殖、转移过程，对癌症发病机制研究有一定参考价值[10]。因此，探究miR-21与肺癌脑转移患者临床病理特征及预后的关系有重要意义。

miRNA是小片段(18～23 nt)单链非编码RNA，成熟miRNA可通过与靶基因3′端发生特异度结合，形成RNA诱导沉默化合物调控靶基因的转录，或通过降解靶基因mRNA影响蛋白合成，间接参与细胞程序或肿瘤发生过程[11]。Pfeffer等[12]研究表明miR-21在卵巢癌、B淋巴细胞瘤、肝癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中表达上调，参与癌细胞增殖转移过程。Sun等[13]研究发现miRNA-21在肺腺癌脑转移分子预测中发挥着重要作用，推测miR-21可能与肺癌脑转移有关。本研究结果显示肺癌脑转移患者血清中miR-21表达水平显著高于肺癌非脑转移患者，提示miR-21表达水平可能与肺癌脑转移有关。已有研究表明miR-21可激活STAT3通路调控肺源性脑转移发生[5]，提示miR-21参与肺癌脑转移过程。临床病理特征分析结果显示miR-21表达水平与肺癌脑转移组患者组织分化程度、脑转移病灶数有关，已有研究表明miR-21过表达促进肺癌细胞增殖分化[12]，提示miR-21可能通过促进肺癌癌细胞增殖、分化，影响肺癌组织分化程度，参与肺癌脑转移过程。肺癌脑转移患者自然生存时间仅为1～2个月[9]，miR-21参与肺癌脑转移过程，推测miR-21表达水平可能影响肺癌脑转移患者预后。研究发现miR-21高表达患者3年无进展生存率和总生存率显著低于miR-21低表达患者，提示miR-21表达水平影响肺癌脑转移患者预后。COX分析结果显示，miR-21表达水平是影响患者不良预后发生的危险因素之一，提示miR-21高表达降低患者生存率，影响患者不良预后的发生。

PTEN是一种非冗余脂质磷酸酶，是常在癌症中失活的抑癌基因，其正常表达可抑制肿瘤细胞的侵袭、转移和生长，该基因突变、缺失、转录沉默均可诱导肺癌、前列腺癌、结肠癌等癌症发生[14]。研究表明PTEN在非小细胞肺癌患者肿瘤晚期失活，导致抑癌作用消失，肿瘤细胞具有更强的转移性和侵袭性[15]，提示PTEN蛋白低表达可能促进肺癌细胞转移。本研究结果显示肺癌脑转移患者血清中PTEN蛋白表达水平显著低于肺癌非脑转移组患者，提示PTEN低表达可能与肺癌脑转移发生有关。临床病理特征分析发现PTEN表达水平与患者组织分化程度、病灶转移数有关，提示PTEN低表达减轻对癌细胞的抑制作用，可能影响组织分化、增强转移性。随访结果显示PTEN低表达患者无进展生存率和总生存率显著低于PTEN高表达患者，提示PTEN表达水平可能是影响肺癌脑转移患者预后的危险因素。COX回归分析结果显示PTEN是肺癌脑转以患者不良预后发生的危险因素，提示PTEN低表达或缺失表达促进肺癌细胞脑转移患者疾病进展，影响患者预后。PTEN/PI3K/AKT是重要的细胞通路，可调节细胞生长、分化、增殖、存活、运动、侵袭和细胞内运输等多种细胞功能，与非小细胞肺癌肿瘤发生、转移有关[16]。研究表明miR-92a可通过激活PTEN/PI3K/AKT通路促进非小细胞肺癌癌细胞间质转化过程[6]，提示PTEN/PI3K/AKT信号通路可能受miRNA调控激活。本研究结果显示miR-21表达水平与PTEN蛋白表达水平呈显著负相关，推测miR-21可能与PTEN存在负调控关系。Xue等[17]研究发现miR-21可负调控PTEN表达，促进非小细胞肺癌的发生，结合本研究结果推测miR-21可能通过调控PTEN表达参与肺癌脑转移的发生。但miR-21是否调控PTEN表达及调控机制有待进一步研究。

综上所述，miR-21在肺癌脑转移患者血清中表达上调，PTEN蛋白表达下调，与患者组织分化程度、脑转移病灶数有关，miR-21、PTEN、组织分化程度是肺癌脑转移患者预后的危险因素。但miR-21与PTEN的调控关系及调控机制有待进一步研究。