三种细茎类石斛药材的分子生物学鉴别

陆安静，曾 瑶，杜艺玫，秦 琳，鲁艳柳，张倩茹，谭道鹏，何芋岐

(1.遵义医科大学 国家级药学实验教学示范中心药学实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

据2015年版的《中国药典》规定，石斛类药材的法定来源依其形态性状及化学成分主要分为两大类：来源于金钗石斛DendrobiumnobileLindl.、鼓槌石斛D.chrysotoxumLindl.、流苏石斛D.fimbriatumHook.的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎统称为石斛，而铁皮石斛D.officinaleKimura et Migo的干燥茎被单列为铁皮石斛药材[1]。不同于与金钗石斛等石斛类药材的性状差异较大，以铁皮石斛D.officinale为主要来源的加工品“环草”有较多近似种来源，如细茎石斛D.moniliforme、罗河石斛D.lohohense、广东石斛D.wilsonii等“细茎类石斛”[2]，其中尤以细茎石斛、罗河石斛产量较大，市场上有以细茎石斛、罗河石斛冒充野生铁皮石斛的现象。“细茎类石斛”药材使用极为混乱，植物分类较为困难，甚至各种分类之间也存在较大冲突[3]。因此，传统的药材鉴定方法对于细茎类石斛药材的鉴别存在一定不足。随着现代分子生物学技术的发展，越来越多的DNA分子标记技术逐渐应用到石斛等多基源中药材的鉴定。如樊洪泓等[4]用SRAP技术对部分药用石斛的遗传多样性进行了研究；邱婧等[5]采用RAPD技术对9种药用石斛的遗传多样性及亲缘关系进行了分析；赵庭梅等[6]应用基因组SSR标记对铁皮、金钗、叠鞘三种石斛的遗传学多态性进行了研究；娄勇军等[7]采用ITS2序列对部分铁皮石斛伪品进行了鉴别。但很少有对石斛商品类别种间的研究报道，本文拟通过对铁皮、细茎、罗河三种“细茎类石斛”ITS序列进行比较分析，为混乱复杂的细茎类石斛药材分类鉴别提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 实验样品来见表1。

表1 样品来源信息

1.1.2 主要试剂 新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(GK4005，上海捷瑞生物工程有限公司)、即用型Taq酶PCR试剂盒(GK8006，上海捷瑞生物工程有限公司)、100 bp DNA Ladder(M1200，北京索莱宝科技有限公司)。本研究中使用的引物序列来源于Douzery等[8]设计的对石斛属ITS区的扩增引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 电热恒温水浴锅(DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特仪器有限公司)；超微量分光光度计(ND2000，美国Thermo公司)；PCR扩增仪(C100 Touch，Bio-Rad)；电泳仪电源(DYY-6C型，北京市六一仪器厂)；琼脂糖凝胶电泳仪(DYCP-33A，北京市六一仪器厂)；琼脂糖凝胶成像系统(WP-9413B，北京市六一仪器厂)；DNA测序分析仪(ABI 3730，美国应用生物系统公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 称取约100 mg新鲜样品叶片置于盛有液氮的研钵中并将其充分研磨成粉末状。参照新型快速植物基因组DNA提取试剂盒说明书，在样品中加入550 μL Buffer P1和6 μL RNase A剧烈涡旋振荡1 min，65 ℃孵育20 min；加入130 mL Buffer P2充分混匀，12 000 rpm离心3 min；取上清溶液，加入1.5倍体积的Buffer P3，转移到离心柱中，12 000 rpm 离心1 min；加入Wash Solution漂洗两次；加入100 μL AE Buffer溶解，利用超微量分光光度计对所提的DNA浓度进行检测；-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 采用Bio-Rad 普通PCR扩增仪完成PCR扩增反应，体系为：2×Tap Master Mix 25 μL，Primer F 0.3 μL，Primer R 0.3 μL，DNA (50 ng/μL) 5 μL，加灭菌的ddH2O补足至50 μL。 DendrobiumF：TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGG，DendrobiumR：CGTAACAA GGTTT CCGTAGGTGAAC。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃末端延伸10 min，共39个循环。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，缓冲液为0.5×TBE缓冲液，电泳条件为：160V，60min。

1.2.3 DNA序列测定 经电泳检测合格后的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司采用标记终止物法对每个样品进行单向测序。

1.2.4 数据分析 利用Clustalx对石斛样品序列进行排序；对排序后的序列在NCBI数据库进行Basic Local Aligment Search Tool (BLAST)分析；利用R 3.5.3语言中工具包phangorn的heat-map.2函数对9个石斛样品的ITS序列进行可视化处理；利用FigTree v1.3.1软件构建进化树。

2 结果

2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 对9个石斛样品rDNA ITS区(包括部分18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2和部分26S rDNA)PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，左边泳道为DNA Maker，泳道1～9为PCR扩增产物。其中，泳道1～3模板为罗河石斛的PCR产物，泳道4～6模板为铁皮石斛的PCR产物，泳道7～9模板为细茎石斛的PCR产物，均在700～800bp之间出现单一、明亮且清晰的条带(见图1)。

图1 石斛样本ITS区扩增条带琼脂糖凝胶电泳图

2.2 石斛样本ITS序列的BLAST结果 将以上9个样品的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，对所得序列在NCBI网站分别进行Nucleotide BLAST分析。分析结果如表2所示，BLAST分析中，匹配得分越高，表示相似度越高；E值越小，表示比对结果越可信；一致性表示比对序列与数据库序列能匹配的比例；缺失值代表序列中插入或缺失的比例。通过BLAST进行种属比对，9个样本的ITS序列与Genebank中同属物种序列一致性均在99%，1～3号为D.lohohense(罗河石斛)，4～6D.catenatum(铁皮石斛)，7～9号为D.moniliforme(细茎石斛)，可以准确地对物种进行鉴别。

表2 样本ITS序列比对结果

2.3 石斛样品ITS序列分析 利用Bio Edit软件对9个样品的ITS序列进行比对，罗河石斛(1～3号)样品ITS序列长度分别为693bp，692bp，692bp，A占碱基总数的均值为23.40%，T占23.93%，G占23.69%，C占28.98%，(G+C)含量占52.67%，(A+T)含量占47.33%；铁皮石斛(4～6号)样品ITS长度分别690bp，690bp，688bp，A占碱基总数的均值为22.78 %，T占24.22 %，G占24.42 %，C占28.58 %，(G+C)含量占53.00 %，(A+T)含量占47.00 %；细茎石斛(7～9号)样品ITS序列长度分别为687bp，691bp，688bp，A、T、G、C占碱基总数的均值分别为23.04%、22.36%、24.83%、29.77%，(G+C)含量占54.60 %，(A+T)含量占45.40 %(见图2)。

图2 石斛样品1～9石斛样品的ITS序列

2.4 聚类与亲缘关系分析 对9个石斛样本的ITS序列进行聚类分析，如图3所示，图中的每个矩形小方块代表一个样本的DNA序列。9个石斛样本明显分为三类，罗河石斛(1、2、3)聚为一类，铁皮石斛(4、5、6)聚为一类，细茎石斛(7、8、9)聚为一类。为进一步探讨铁皮石斛、罗河石斛、细茎石斛之间的亲缘关系，对9个石斛样本的ITS序列构建进化树，结果见图4。细茎石斛(7、8、9)与铁皮石斛(4、5、6)的亲缘关系较近，与罗河石斛(1、2、3)的亲缘关系较远，罗河石斛(1、2、3)与铁皮石斛(4、5、6)的亲缘关系最远。

图3 9个石斛样本的可视化热图

图4 9个石斛样本的进化树图

3 讨论

石斛属植物种类繁多，而石斛类药材在数千年的传统医学临床应用中涉及到的品种多达60余种[3]，甚至有些石斛类药材并非来源于石斛属植物。自中华人民共和国成立以来，石斛类药材的法定来源由1963年版《中国药典》规定的石斛属植物逐步固定为铁皮石斛及石斛两大类，后者是指来源于金钗石斛D.nobile、鼓槌石斛D.chrysotoxum、流苏石斛D.fimbriatum的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎的统称。传统认为铁皮石斛是优质的石斛药材[7]，其加工品可分为：枫斗、环草、黄草等商品药材类别，其中商品“环草”石斛的药材来源除铁皮石斛D.officinale外，还包括细茎石斛D.moniliforme、罗河石斛D.lohohense、广东石斛D.wilsonii等“细茎类石斛”，特别是细茎石斛、罗河石斛还有较大的产量和使用地域[2,9]。

细茎类石斛药材的原植物分类较为困难，并且不同分类方法之间存在较大冲突，致使细茎类石斛药材来源更为混乱。尤其是铁皮石斛与细茎石斛的分类存在较大争议，如2005年版以前中国药典铁皮石斛拉丁名为D.candidum，1999年版《中国植物志》及2010版以后《中国药典》铁皮石斛拉丁名为D.officinale，而2009年出版的中国植物志英文版《Flora of China》又将铁皮石斛D.officinale与霍山石斛D.huoshanese、黄石斛D.tosaense合并为同一个种D.catenatum，中文名定为黄石斛。金效华[10]对中药石斛的植物来源考证发现不同的学者对铁皮石斛及细茎石斛的来源存在较大的异议，如Pearce & Cribb将D.officinale处理为D.candidum的异名，Wood认为D.candidum是D.moniliforme的异名，将D.officinale，D.tosaense处理为D.catenatum的异名，Jin等将D.candidum，D.huoshanense处理为D.moniliforme的新异名，Zhu等将D.huoshanense，D.tosaense，D.officinale处理为D.catenatum的新异名与2009版《Flora of China》一致，由此说明仅凭植物形态、药材性状对铁皮石斛药材亲缘关系较近的植物进行鉴别非常困难。罗河石斛分布于贵州省大部分地区及广西、四川、云南、湖南、湖北、广东等省部分地区[11]，历来在地方上被作为石斛药材使用，是“细茎类石斛”药材的主要来源之一。李涛等[12]对其从植物形态、药材性状、显微结构等方面做了研究，但整体而言，关于罗河石斛的研究报道甚少。本文通过ITS序列对三种“细茎类石斛”的鉴别发现能够很好的区分其各自来源，可以为“细茎类石斛”药材的鉴别及质量评价提供参考。