人参皂苷Rg3对大鼠血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

仇治梅，陈文明，王 艳，石 蓓

(遵义医科大学附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563099)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease,CHD)目前已成为全球范围内导致死亡的重要原因[1]。其常见的治疗方式为经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)，但PCI本身所造成的血管内膜机械性损伤，导致支架内再狭窄(Restenosis in-stent,RS)的发生、发展，严重影响介入术后患者的生存质量和远期预后[2]。PCI术后RS发生的主要原因是血管内膜损伤后诱导血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)过度增殖，由中膜迁移至内膜，导致管壁增厚，最终导致RS的形成[3]。故而，抑制血管平滑肌的过度增殖迁移是治疗RS的关键。

人参为我国传统名贵中药材，具有补气益肺、安神益智的功效。人参皂苷(Ginsenosides,GS)是人参生理活性的主要物质基础，其中人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3，GSRg3)属四环三萜类皂苷。近年来对GSRg3的研究逐渐深入，发现其具有抗肿瘤[4]、降低化疗药物的心脏毒性和肾毒性[5]、抗疲劳[6]等广泛药理作用。但是，GSRg3对血管再狭窄方面的研究较少。我们前期的研究结果发现，在大鼠颈动脉球囊损伤模型中，GSRg3能抑制颈动脉血管内膜增生[7]，说明GSRg3有抗血管再狭窄效应，但是具体的作用机制仍不清楚。因此，本研究通过观察GSRg3对体外培养VSMCs凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 GSRg3(批号为ZL20161016，纯度>98%，购自上海笃玛生物科技有限公司)；MTT(Sigma公司，美国)；DMEM培养液、青霉素(10 000 μg/mL)/链霉素(10 000 μg/mL)双抗、胰酶(HyClone公司，美国)；胎牛血清(MRC公司，澳大利亚)；凋亡试剂盒(北京四正柏生物科技公司)；SM α-actin抗体、β-actin抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体(博士德公司)；cleaved caspase 3、cleaved caspase 9(CST公司，美国)；HRP标记的羊抗兔二抗(Proteintech，美国)；SD大鼠10只，雌雄不限，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 VSMCs细胞培养与鉴定 SD大鼠断颈处死，浸泡于75%乙醇中10 min，无菌条件下取出胸主动脉，置于4 ℃预冷的无菌PBS中，去除血管外膜附着组织，直镊夹住胸主动脉一端，弯镊沿直镊端滑至对侧端，快速袖套样剥脱外膜，眼科剪纵向剖开血管，无菌棉签于血管内膜表明刮去血管内膜细胞，预冷无菌DMEM清洗。将血管组织剪为1.0 mm3大小组织块，将组织块按3～5块/cm2密度接种到25 cm2细胞培养瓶中，瓶底向上，加入2 mL含20% FBS的DMEM培养基，在37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中，6 h后原位缓慢翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，72 h换液。倒置相差显微镜观察细胞生长状态，7 d左右可见长梭形细胞密度达70%，待细胞密度达80%左右时，用0.25%胰酶消化传代培养，SM α-actin免疫荧光鉴定VSMCs，取P3-P8代细胞进行后续实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖活性 取生长状态良好的细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液。以1×105/mL密度接种到96孔板中，每孔200 μL，实验组分别加入不同浓度(25、50、100 μg/mL)的GSRg3。正常对照组加入含10% 胎牛血清的DMEM培养液。设置3个复孔，作用24 、48 h后，取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，继续在CO2孵箱中培养4 h 即有甲簪生成，弃掉上清液。每孔加入DMSO 150 μL，摇床上避光振荡10 min，使其充分溶解，用酶标仪于492 nm波长检测OD值。细胞增殖抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 Annexin V- FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡 取对数生长期的细胞，GSRg3(25、50、100 μg/mL)作用48 h后消化离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，调整细胞密度达1×106/mL，加入5 μL Annexin V/FITC混匀，再加入10 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，上机检测。

1.5 Western blot检测VSMCs中凋亡相关蛋白的表达 将对数生长期的细胞接种于培养基中，按各分组分别对各组细胞进行干预后，提取细胞总蛋白并测定浓度。将提取的总蛋白与5×蛋白上样缓冲液按4∶1比例混匀后变性(99 ℃，8 min)，等量上样于10% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，然后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜电转，5% 的脱脂牛奶封闭1 h，加入羊抗鼠一抗(Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、β-actin 1∶1 000、cleaved caspase 3 1∶1 000、cleaved caspase 9 1∶1 000)4 ℃孵育过夜，弃一抗后加HRP偶联羊抗兔IgG抗体室温摇床孵育1 h，TBST漂洗后用显色剂ECL显色、曝光。使用Image Pro Plus软件测定灰度值。

2 结果

2.1 大鼠血管平滑肌细胞的分离培养及鉴定 如图1所示，原代培养时，细胞培养第5～7天即可见数个细胞以垂直方向从组织块边缘游出，继续培养，组织块周围可见明显的生长晕，约14 d左右，生长晕不断扩大，细胞呈典型的“峰谷”样结构特征。采用SM α-actin进行鉴定，绿色为SM α-actin特异性染色，DAPI染色细胞核为蓝色。

图1 VSMCs的培养及免疫荧光鉴定

2.2 GSRg3可抑制VSMCs增殖 不同分组的VSMCs加入不同浓度的GSRg3处理，然后置于37 ℃，5%CO2培养箱中继续培养24 h。在相差显微镜下观察VSMCs的生长状况及形态变化。结果如图2所示，正常对照组细胞生长良好，随着GSRg3浓度由25 μg/mL增加至100 μg/mL，细胞生长明显受到抑制，细胞间连接减少，且随着GSRg3浓度的增加，细胞生长活性受影响越明显。

图2 不同浓度GSRg3干预24 h后VSMCs的形态变化

同时MTT比色法结果显示(见表1)，GSRg3抑制VSMCs的增殖，且随着Rg3浓度及作用时间的增加，抑制增殖的能力逐渐增强。

表1 GSRg3对VSMCs的增殖抑制率

2.3 GSRg3诱导 VSMCs细胞凋亡 Annexin V- FITC/PI双标记流式细胞术检测发现(见图3)，GSRg3作用于VSMCs 48 h，正常对照组、25 μg/mL GSRg3组、50 μg/mL GSRg3组、100 μg/mL GSRg 3组VSMCs总体凋亡率(早凋+晚凋)分别为(6.98±0.57)%、(16.12±1.15)%、(23.89±1.14)%、(31.69±2.13)%，见图3。提示，相对于正常对照组，加入不同浓度的GSRg3后，VSMCs凋亡率有所增加，且随着GSRg3浓度的增加，其诱导VSMCs凋亡率也增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

*：与对照组相比，P<0.05； n=3。图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡

2.4 GSRg3对VSMCs凋亡相关蛋白表达的影响 为了进一步解析GSRg3促进VSMCs凋亡的机制，采用Western blot检测凋亡相关蛋白。由图4可见，不同浓度的GSRg3作用于VSMCs 48 h后，相比于对照组，GSRg3能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，并且呈剂量依赖，VSMCs中Bcl-2/Bax的比率明显下调。此外，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9蛋白表达均有一定程度上调，与对照组相比，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9的表达在GSRg3 50、100μg/mL组的表达显著上调(P<0.05)。

*：与对照组相比，P<0.05； n=3。图4 不同浓度GSRg3对凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)严重危害着人们的健康和生活质量，PCI是临床治疗CHD的重要手段，然而，PCI会造成血管内膜的机械损伤，最终造成RS。血管损伤后再狭窄的实质是机体对损伤动脉壁的过度修复反应，主要表现为炎症、新生内膜形成和血管重塑，其中血管平滑肌细胞的过度增殖与迁移可能在RS中起着比较重要的作用。因此，寻求能抑制平滑肌细胞增殖，诱导平滑肌细胞凋亡的且又具有低毒性的新型药物是非常必要的。

既往研究发现，GSRg3对胰腺癌[8]、胃癌[9]、非小细胞肺癌[10]等肿瘤细胞均有一定的作用。Cho等[11]在人脐静脉血管内皮细胞和小鼠中发现GSRg3可以通过抑制白细胞黏附血管壁而治疗血管炎症疾病，发挥血管保护作用。我们前期研究结果显示，在大鼠颈动脉球囊损伤模型中，GSRg3能抑制颈动脉血管内膜增生，但具体作用的分子机制并不清楚。本研究通过MTT法检测发现GSRg3对大鼠VSMCs有增殖抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。流式检测结果显示，GSRg3不同药物浓度作用于VSMCs 48 h后，VSMCs中凋亡细胞的比例明显高于对照组，且GSRg3呈浓度依赖性，由此推断GSRg3可以通过诱导凋亡抑制VSMCs的活性。

细胞凋亡是严格受到细胞信号调控的自主性消亡的过程。它涉及到一系列的基因激活、表达和调控作用。目前，介导细胞凋亡的信号通路主要有三条：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路。在脊椎动物细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。其中，caspase 9和caspase 3为线粒体通路的主要效应分子[12]，当线粒体通透性增加，线粒体内促凋亡因子如Cyt C等释放到胞质中，Cyt C 与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease-activating factor,Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1 氨基端的Caspase 募集结构域，募集胞质中的Caspase-9 前体，并使其自我剪切活化，然后启动Caspase 级联反应，激活下游的Caspase 3/7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡。我们通过GSRg3处理VSMCs后检测cleaved caspase 3、cleaved caspase 9的表达，结果发现cleaved caspase 9、cleaved caspase 3的表达均升高。提示GSRg3诱导VSMCs凋亡与线粒体通路密切相关。在该途径中，Bcl-2家族蛋白通过调节膜电位从而控制线粒体膜通透性来控制凋亡[13]。根据它们在凋亡中的作用可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。抗凋亡蛋白Bcl-2定位于线粒体外膜，抑制细胞色素C(Cyt C)的释放，而含BH3结构域的促凋亡蛋白Bax在收到凋亡信号后，发生寡聚化，从胞浆转移到线粒体膜上，引起线粒体通透性改变，跨膜电位丢失，释放Cyt C，促进细胞凋亡。本实验中，与对照组相比，不同浓度GSRg3作用于VSMCs后，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调，促凋亡蛋白Bax明显上调，提示GSRg3作用与VSMCs增强Bax蛋白的表达，从而促进线粒体途径的细胞凋亡。

综上所述，GSRg3通过促进Bax、cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表达，抑制Bcl-2的表达，从而诱导VSMCs凋亡。