柱层析循环联合法提取双刺参胶囊中的总皂苷及多糖

邸 松，戴丽莹，钟方丽，张晓丽，2，王晓林*

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022； 2.吉林大学，长春 130012)

伴随医学模式从传统的生物医学过度到全新的生物-心理-社会医学的模式[1]，亚健康这种处于健康与疾病之间的第三状态[2]，受到人群的广泛关注.疲劳性亚健康是亚健康中一种常见类型[3]，在人群中的发生率约为7%～45%[4]，长期处于该状态下的人群可能导致癌症、人体免疫性缺陷、病毒感染等疾病[5-6].随国民健康意识的不断提高，保健食品这种不以治疗疾病为目的，具有特定保健功能的食品需求量持续提升[7].在保健食品的27种保健功能中[8]，具有抗疲劳功效的保健食品可以有效的改善疲劳状态.课题组选用三种药食同源[9]、具有抗疲劳作用的刺玫果[10]、人参[11]及刺五加[12]进行处方设计，采用提取、制剂技术制备成具有抗疲劳功效的中药类保健食品[13]双刺参胶囊.

经文献查阅，中药材中皂苷类成分的提取，通常采用乙醇热回流[14]、超高压提取[15]、超声提取[16]和酶辅助超声提取[17]等方法.这些方法的乙醇投入量大、能源消耗高，且只能有效的提取一种有效成分.本试验参考韩寒冰[18]的方法，采用柱层析循环联合法，探索同时提取双刺参胶囊中的总皂苷及多糖的最佳工艺，为双刺参胶囊的工业生产提供数据基础.

1材料与方法

1.1试验材料

刺五加、刺玫果、人参：购买于吉林国安药业有限公司，于60 ℃下干燥至恒重后粉碎，取过80目筛粉末，按处方量进行混合得到双刺参混合粉；香草醛：天津市光复精细化工研究所；苯酚、无水乙醇及其他分析纯试剂：天津大茂化学试剂厂.

1.2试验仪器

TU-1950型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；H1850型台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司.

1.3试验方法

1.3.1总皂苷及总多糖含量测定方法

1) 总皂苷含量测定采用香草醛-乙醇-硫酸显色法[19]，吸取提取液适量，80 ℃水浴蒸干溶剂，加入0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液溶解残渣后，加入5 mL 72%硫酸溶液混合均匀，置于60 ℃水浴震荡(150 r·min-1)15 min，冷水浴迅速冷却10 min，室温静置15 min后，在540 nm下测定吸光度，带入标准曲线方程(y=23.01x+0.0577，R2=0.9994)，将测定值带入公式(1)计算总皂苷提取率.

(1)

式中,ρZ为提取液中皂苷浓度(mg·mL-1)；VZ为总皂苷提取液体积(mL)；mZ为双刺参粉中总皂苷的总量(mg).

2) 总多糖含量测定吸取提取液适量，按照苯酚-硫酸显色法进行测定[20]，将测定的吸光度数值带入标准曲线方程(y=38.698x+0.0597，R2=0.9997)，将测定值带入公式(2)计算计算总多糖提取率.

(2)

式中,ρT为提取液中多糖浓度(mg·mL-1)；VT为多糖提取液体积(mL)；mT为双刺参粉中多糖的总量(mg).

1.3.2提取工艺条件的选择

1) 提取溶剂的选择称定双刺参粉末6份，每份1.0 g，分别按照料液比1∶10(g∶mL)加入体积比(乙醇∶水)为10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10的提取溶剂，室温下摇床震荡1 h(200 r·min-1)，低温离心(6000 r·min-1)10 min，取上清液适量，分别按照总皂苷及多糖的含量测定方法测定，计算总皂苷及多糖的提取率，分别确定双刺参总皂苷及多糖的提取溶剂.

2) 吸涨率的测定取1.0 g双刺参粉末16份，分别按照料液比1∶10(g∶mL)加入总皂苷提取溶剂及多糖提取溶剂，室温下分别摇床震荡10 min(200 r·min-1)、20 min、0.5、1、2、3、4、5 h后，离心，测定上清液体积，其与总体积的差值即为吸涨率(吸涨体积).

3) 浸泡平衡时间的测定在测定吸涨率时，分别测定不同震荡时间上清液中总皂苷及多糖的含量，当上清液中对应的总皂苷及多糖含量基本不变时所对应的时间，即为浸泡平衡时间.

1.3.3柱层析法分别提取双刺参总皂苷及总多糖

1) 提取次数的确定取直径为1.5 cm的玻璃层析柱，称取双刺参粉末5.0 g，按料液比(m∶V)1∶1加入提取总皂苷对应的提取溶剂，混合均匀后湿法上柱，保持溶剂没过样品，浸泡至平衡时间，以0.4 mL·min-1收集流出液，对应吸涨体积为1份，收集3份后，残渣加入吸涨体积的提取溶剂，经超声提取1 h后抽滤，得到第4份提取液，分别测定各份提取液中总皂苷含量，4份提取液中总皂苷的含量之和视为双刺参粉中总皂苷的总量，根据实验数据确定提取次数.以纯水为提取溶剂，采用同样的方法，确定双刺参粉中多糖的总量及其提取次数.

2) 提取流速的确定选取直径为1.5 cm的玻璃层析柱，按1.3.3方法进行上柱，以吸涨体积为一个收集单位，分别以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL·min-1的流速收集提取液，测定洗脱液中总皂苷的含量，从而确定总皂苷的提取流速.以纯水为提取溶剂，采用同样的方法确定多糖的提取流速.

1.3.4柱层析循环联合法提取双刺参总皂苷及总多糖

1) 直接连续提取法总皂苷及总多糖提取连续进行，优先提取总皂苷.选用4根1.5 cm的玻璃层析柱，称取4份双刺参粉末各5.0 g，湿法上第1根柱，其余操作同分别提取总皂苷的方法，只是根据总皂苷的提取次数，在收集最后一次提取液时，更换为总多糖的提取溶剂纯水，将总皂苷提取溶剂收集完毕，继续添加多糖提取溶剂，按提取次数提取多糖.各洗脱液的最后一份，作为下一根层析柱的第一份洗脱液，从第二根柱开始，不浸泡至平衡时间，如此循环，测定并计算总皂苷及多糖提取率.

2) 浸泡至平衡时间连续提取法提取方法同上，不同的是，在更换提取溶剂及提取下一根层析柱时，须在层析柱内静置浸泡至平衡时间后再进行接样，并测定含量，计算提取率.

1.3.5总皂苷及多糖的分离 将双刺参总皂苷及总多糖的提取液合并，减压浓缩至20 mL，加入无水乙醇80 mL，充分混合均匀，置于4 ℃冰箱静置12 h，低温离心10 min(6 000 r·min-1).上清液为总皂苷液，沉淀为粗多糖.将上清液减压浓缩，分别将浓缩液与粗多糖置于60 ℃烘箱中进行干燥，得到干浸膏，分别测定干浸膏中总皂苷及多糖含量.

1.3.6多糖的纯化 取粗多糖重新溶于蒸馏水中，80%乙醇进行沉淀，放置在冰箱(4 ℃)中12 h后进行离心10 min(6 000 r·min-1)，将所得沉淀重复上述实验1次，经干燥后得到多糖粉末，测定多糖含量.

1.4双刺参总皂苷体外抗氧化试验

1.4.1清除DPPH自由基试验 吸取0.1 mg·mL-1DPPH自由基溶液17 mL于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇定容，制备DPPH自由基溶液.吸取2 mL不同质量浓度的供试品溶液(总皂苷提取物溶液和Vc溶液)与2 mLDPPH自由基溶液，混合，混合液在室温下避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度Ay，同法操作，用2 mL无水乙醇代替供试品溶液测定Ak，2 mL无水乙醇代替DPPH自由基溶液测定Ad[21]，按式(3)计算自由基清除率，并其计算IC50值.

DPPH自由基清除率(%)=

[(Ak-Ay+Ad)/Ad]×100%.

(3)

1.4.2清除羟基自由基试验 参考文献[22]的方法，在10 mL比色管中加入1 mL邻二氮菲，2 mLPBS缓冲液(pH=7.4)，1 mL FeSO4及1 mL 0.1%的H2O2溶液，37 ℃恒温条件下反应60 min，于536 nm处测得Ap，将1 mL 0.1%的H2O2溶液替换为1 mL蒸馏水，同法操作测得Ab，用1 mL不同质量浓度的双刺参提取物溶液替换1 mL蒸馏水测得As，将测得数据代入式(4)计算清除率及IC50.

羟基自由基清除率(%)=

[(As-AP)/(Ab-Ap)]×100%.

(4)

2结果与分析

2.1提取工艺条件的确定

2.1.1提取溶剂的确定 皂苷类成分易溶于乙醇溶液，多糖类成分易溶于水，根据测定的各溶液中总皂苷及多糖含量绘制图1，从图1可以看出，当提取溶剂体积比(乙醇:水)为4∶6时，提取液中总皂苷的浓度达到最大值5.59 mg·mL-1，当提取溶剂体积比(乙醇:水)为0∶10(纯水)时，提取液中多糖的浓度达到最大值35.56 mg·mL-1，故在柱层析循环提取时，总皂苷提取溶剂选用40%乙醇溶液，多糖提取溶剂选择纯水.

图1 提取溶剂的选择Fig.1 Selection of extraction solvent

2.1.2吸涨率及浸泡平衡时间的确定 通过测定，双刺参粉末对40%乙醇溶液及纯水的吸收量不相同，从图2可以看出，两者分别为3.8 mL·g-1和3.6 mL·g-1，故提取总皂苷时按照双刺参粉末质量的3.8倍(g∶mL)收集提取液，提取总多糖时按照双刺参粉末质量的3.6倍(m∶V)进行收集.通过对提取液中多糖及总皂苷的含量测定，随着浸泡时间的延长，提取液中总皂苷及多糖的质量浓度逐渐升高，在浸泡时间达到2 h后，提取液中总皂苷及多糖的质量浓度变化不大，因此确定样品在层析柱中的浸泡时间为2 h，试验结果见图3.

图2 吸涨率的测定结果Fig.2 Measurement results of swelling rate

图3 浸泡时间的确定Fig.3 Determination of Soaking Time

2.2柱层析法分别提取双刺参总皂苷及总多糖工艺条件的确定

2.2.1提取次数的确定 通过测定双刺参总皂苷及总多糖的3份提取液及1份残渣超声提取液中对应总皂苷及多糖的含量，以4份提取液中的总含量作为总量，当提取液中提取的对应成分达到总量的95%以上时，视为完全提取，试验结果见图4.根据试验结果，总皂苷需要收集2份提取液，第2份提取液因浓度较低，作为下一根层析柱总皂苷提取溶剂；多糖因前2份提取液提取率相差不大，故需要收集3份提取液，第3份提取液作为下一根层析柱多糖的提取溶剂.

图4 提取次数的确定Fig.4 Determination of extraction times

2.2.2洗脱流速的确定 从图5中可以看出，当洗脱流速在0.2～0.4 mL·min-1时，洗脱液中总皂苷及多糖的质量浓度相差不大，当洗脱流速增加到0.6 mL·min-1及以上时，洗脱液中的总皂苷及总多糖的质量浓度明显下降，考虑实际生产需求，以0.2 mL·min-1的流速进行收集，总皂苷和多糖的提取效率略有提升，但生产效率较低，所以选择0.4 mL·min-1的流速进行收集.

图5 洗脱流速的确定Fig.5 Determination of elution flow rate

图6 提取方式比较Fig.6 Comparison of extraction methods

2.3柱层析循环联合法提取双刺参总皂苷及总多糖

从图6可以看出，采用直接连续提取法时，从第二根层析柱开始，总皂苷及多糖的提取率明显下降，虽然提取率呈现递增趋势，但总皂苷及多糖的整体提取率低于65%.浸泡至平衡时间提取时，总皂苷及多糖的提取率逐渐提升，在第四根层析柱时总皂苷及多糖的提取率分别达到96.56%和99.37%.故选用浸泡至平衡时间提取总皂苷及多糖.

2.4总皂苷及总多糖分离试验结果

将双刺参总皂苷及总多糖的循环提取液合并后，经浓缩、醇沉、干燥，分别得到总皂苷及粗多糖干浸膏，称重，并测定干浸膏中多糖及皂苷的含量，计算干浸膏收率，试验结果见表1.

表1 总皂苷及总多糖分离试验结果Tab.1 Test results of total saponins and total polysaccharides

2.5多糖纯化试验结果

对得到的粗多糖进行2次水溶醇沉法纯化后，干燥，经过测定，纯化后的多糖含量从粗多糖的48.37%提升到了69.91%.

2.6总皂苷抗氧化试验结果

双刺参总皂苷提取物清除DPPH自由基、羟基自由基能力与浓度呈正相关趋势，即随着总皂苷质量浓度的增加，清除率随之增大.通过计算，总皂苷对两种自由基清除的半数抑制浓度分别为8.93、12.99 mg·mL-1，与Vc的半数抑制浓度3.88、1.43 mg·mL-1相比差距较大，说明双刺参总皂苷具有一定的抗氧化能力，但是弱于Vc.

图7 抗氧化试验结果Fig.7 Antioxidant test results

3结论与讨论

本试验通过柱层析联合循环提取，分别采用料液(m∶V)比为1∶3.8的40%乙醇、1∶3.6的纯水，浸泡2 h后，以0.4 mL/min的流速提取双刺参粉末中的总皂苷及多糖.在此条件下，总皂苷及多糖的提取率均超过95%，混合提取液经醇沉法一步分离，得到皂苷溶液及多糖沉淀，经干燥后测定总皂苷及多糖的干浸膏得率分别为16.08%和3.68%；干浸膏中总皂苷及多糖的含量分别为18.06%和48.37%.粗多糖经2次水溶醇沉后，多糖含量从48.37%提升到了69.91%.

天然植物中活性成分如皂苷、多糖等的提取方法有多种，例如，传统经典的溶剂热回流提取、或者采用超声波、微波、酶辅助等来提高提取率，但是这些提取方法都存在着提取次数多、提取温度高、热敏性物质易被破坏、溶剂用量大、每次只提取一种活性成分等缺点，而柱层析循环联合法可以克服上述缺陷.

在前期的研究中，曾对乙醇热回流法提取双刺参胶囊中总皂苷进行工艺优化，在最优条件下，可使总皂苷的提取率达到28.17 mg·g-1，其干浸膏中总皂苷的含量为15.78%.在柱层析循环法联合提取法中，按照同样的方法计算总皂苷的提取率可以达到29.03 mg·g-1，含量为18.05%，与乙醇热回流法相比，提取率及总皂苷含量略有提高.乙醇热回流法的最佳工艺需要5倍量90%乙醇，80 ℃水浴提取2次，每次1 h，相比较于柱层析循环法联合提取的3.8倍40%乙醇，常温条件下提取，在乙醇用量和能源消耗上较大.故柱层析循环联合法需要的溶剂少、提取温度低、能够避免热敏性物质被破坏、工艺简单、在提取总皂苷的同时可以提取总多糖，更有利于工业生产，也为双刺参胶囊的下一步研究提供了实用性数据.