利川产区显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮成分和抗菌活性研究

李 宇，刘翠君，廖璐婧，郭汉玖，冉亚兰，刘 丹，罗建群，何美军*

(1.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000； 2.恩施土家族苗族自治州农业农村局，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000； 4.恩施硒司令生态农业科技发展有限公司，湖北 恩施 445000)

显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand. -Mazz.) W. T. Wang，俗名藤茶(vine tea)，属葡萄科(Vitaceae)、蛇葡萄属(Ampelopsis Michx)植物，广泛分布于我国中、南部的山区，其干燥叶和茎经加工后是常见的药食两用饮品[1].研究发现显齿蛇葡萄粗提取物具有抗氧化、消炎、保护肝脏、抗肿瘤、抗酪氨酸酶、抗糖尿病、降血脂等多种生理功效.显齿蛇葡萄粗提取物能显著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，能显著抑制肉制品的硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的升高和羰基化合物的形成，延长肉制品的保质期[2].代谢组表明显齿蛇葡萄通过参与调节葡萄糖代谢(包括糖异生和糖酵解)，嘌呤代谢和氨基酸代谢等相关途径，降低小鼠模型的血清葡萄糖和总胆固醇水平[3].有文献报道显齿蛇葡萄总黄酮提取物能明显抑制体外培养的胃癌细胞SGC-7901生长[4].显齿蛇葡萄粗提取物的单宁馏分组分(主要成分gallotannins) 具有抗氧化活性(清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)和葡萄糖苷酶抑制活性[5].显齿蛇葡萄总黄酮对原发性高血压大鼠有明显的降血压效果，其潜在的机理是参与调节醛固酮系统与抗氧化系统有关，而且对正常大鼠的血压没有影响[6].从叶和茎中分离到的与酸性蛋白结合的杂多糖具有较强的抗氧化活性和葡萄糖苷酶抑制活性[7].显齿蛇葡萄提取物能改善患血吸虫病小鼠的肝脏纤维化病理状况，对患血吸虫病肝纤维化有明显治疗作用[8].显齿蛇葡萄的茎叶提取物对D-半乳糖胺导致的大鼠肝损伤具有保护作用[9].

研究发现显齿蛇葡萄黄酮总含量≥40%，通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography)、质谱(mass spectrum)和核磁共振(nuclear magnetic resonance)分析鉴定技术发现显齿蛇葡萄中二氢杨梅素(dihydromyricetin)含量高达37%[10].二氢杨梅素被证明有多种生理功能：能通过线粒体介导的凋亡途径诱导人绒毛膜癌细胞(choriocarcinoma cell line JAR)凋亡[11]；能有效减弱增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HPS)的形成[12]；能显著减轻深度睡眠(deep sleep)导致的空间学习和记忆障碍[13].有文献报道从显齿蛇葡萄粗提取物中分离鉴定了5个黄酮苷类化合物：6，7-二羟基-30-甲氧基-40，50-亚甲二氧基异黄酮6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6，7-二羟基-30-甲氧基-40，50-亚甲二氧基异黄酮 6-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、6，7-二羟基-30-甲氧基-40，50-亚甲二氧基异黄酮 6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基-3′，4′-三羟基黄酮-3-O-6″-鼠李糖、5，7-二羟基-3′，4′-二羟基黄酮-3-O-6″-鼠李糖[14-15].

显齿蛇葡萄具有多种生理活性，但是关于显齿蛇葡萄总黄酮的组分、各组分含量、黄酮类化合物的生物合成途径、及二氢杨梅素积累机制等科学问题，暂无文献报道.本论文对显齿蛇葡萄总黄酮组分和抑菌活性进行了全面分析，可为显齿蛇葡萄在保健食品领域，及食品保鲜领域的充分开发与利用提供理论依据.

1材料与方法

1.1仪器与材料

Bruker maXis高分辨飞行时间质谱仪，Agilent 1260高效液相色谱仪(配DAD检测器)，Phenomenex 色谱柱(50 mm × 4.6 mm，ODS 5 μm)，imark酶标仪(Bio-Rad美国伯乐)，Agilent Poroshell 反相色谱柱 120 EC-C18(4.6×150 mm，4 μm)，RE-200A旋转蒸发仪(广州市星烁仪器有限公司)，Thermo Fisher世尔电导仪(型号：3-star)，HS-GF254硅胶薄层板；J&K色谱纯乙腈，黄酮化合物标准品二氢杨梅素、三叶豆苷、山柰酚、杨梅苷(myricitrin)、杨梅素(myricetin)、花旗松素(taxifolin)、槲皮素(quercetin)均购自于阿拉丁试剂公司，其它试剂均为国产分析纯.所有供试菌都是中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室鉴定.显齿蛇葡萄样品是从湖北省利川市齐岳山(海拔1 000 m～1 200 m)采集，湖北省农业科学院中药材研究所高级农艺师由金文鉴定.

LB培养基配制：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌30 min(固体LB培养基加入琼脂20 g·L-1).

MH液体培养基配制：牛肉粉2 g·L-1，可溶性淀粉1.5 g·L-1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L-1，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌30 min.

1.2试验方法

1.2.1显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮提取 干重为5 g的显齿蛇葡萄嫩叶磨成粉，按料液比1∶50，用250 mL乙醇溶液(60%)浸泡18 h，200 W超声提取30 min.10 000 r· min-1离心获得上清液，上清液减压旋蒸，得到浸膏.

1.2.2显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮组分鉴定 显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮提取上清液样品稀释10倍备用，高效液相色谱(HPLC)进样条件：时间0 min～20 min，B相95%～20%，时间20 min～25 min，B相20%～0%，时间25 min ～27 min，B相0%～0%，时间27.1 min～30 min，B相95%～95%.A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸.MS分析条件：质谱仪器micrOTOF (Q)，离子化模式positive，离子源电压4 500 V，End Plate Offset -500 V，Dry Heater 180 ℃，Corrector Fill 70 V，Dry Gas 5.0 I·min-1，Reflector 2 107.7 V，Flight Tube 10 000.0 V，Detector TOF 3 250.0 V，Corrector Extract 429.5 V，一级质谱扫描范围：100～2 000 m·z-1.运用Bruker compass DataAnalysis 4.0数据分析软件进行质谱数据分析处理，并在中药成分高分辨质谱数据库Orbitrap Traditional Chinese Medicine Library (OTCML)检索分析[16].

1.2.3显齿蛇葡萄嫩叶各黄酮组分含量测定 利用HPLC外标法[17]测定显齿蛇葡萄嫩叶各黄酮组分含量，将7个标准品二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素、花旗松素、槲皮素配制成6个浓度梯度(10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、40.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、160.0 μg·mL-1、320.0 μg·mL-1)的混标，运用1.2.2的HPLC进样条件测量.测定仪器信噪比(S/N) ，当各标准溶液稀释至信噪比3

其中，C为显齿蛇葡萄样品中黄酮组分含量，n为HPLC检测浓度，m为显齿蛇葡萄样品干重

1.2.4显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮抗菌活性测试 采用滤纸片法[18]测试显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮物对10株供试菌的抑菌活性，取20 μL培养至A600为0.6的测试菌菌液与20 mL LB固体培养基混合均匀倒平板.取15 μL显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮(二甲基亚砜DMSO溶解)，分三次滴加于滤纸片(直径为6 mm)上，将滤纸片置于混有菌液的培养基上，另设氨苄青霉素(100 mg·mL-1)作阳性对照、添加DMSO作阴性对照，37 ℃培养12 h，测抑菌圈.参照抗生素药敏标准：高敏(抑菌圈直径>20 mm)、中敏(10～20 mm)、轻敏或耐药(<10 mm).采用微量肉汤稀释法测定显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮对供试菌的MIC值，按美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M07-A9的标准操作程序：在96孔板上3～12列的每孔加入含总黄酮样品的MH液体培养基100 μL，设置显齿蛇葡萄总黄酮终浓度分别为128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5和0.25 mg·mL-1(3～12列).将培养好的菌液稀释1 000倍，每孔加入稀释菌液100 μL，设氨苄青霉素(100 μg·mL-1)作阳性对照，第1列为空白培养基对照，第2列为菌液生长空白对照(加DMSO)，第3～12列为样品测试列.37 °C培养16 h后使用imark酶标仪检测A600，根据CLSI M100-S26标准：与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长的药物浓度为受试菌的MIC值[19-20].

1.2.5数据处理 所有实验数据运用SPSS 19.0 软件进行统计分析，实验数据以“平均值±标准偏差”表示.P<0.05，表明具有显著性差异，P<0.01，表明具有极显著性差异.

2试验结果与讨论

2.1显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮获得

共获得250 mL总黄酮提取液，取10 mL加甲醇稀释10倍，用于显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮组分鉴定和含量检测.240 mL总黄酮提取液减压旋蒸共获得提取浸膏2.026 g，加入4 052 μL DMSO溶解，获得浓度为0.5 g·mL-1的总黄酮溶液备用.

2.2显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮组分鉴定

运用Bruker Compass DataAnalysis 4.0数据分析软件，依据黄酮类化合物的UV吸收特征(紫外吸收区域内存在2个主要的峰带Ⅰ和峰带Ⅱ)，共从显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮组分中鉴定出21个类似黄酮类化合物离子峰，进一步在中药成分高分辨质谱数据库 (OTCML)检索计算，共从显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮中鉴定出7个黄酮类化合物(如表1).

表1 显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮组分鉴定Tab. 1 Identification of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

注 1)a：mSigma同位素匹配度；

2)b：设定质量标准差≤10 ppm(单位ppm)

运用1.2.2的HPLC进样条件，HPLC外标法测量7个标准品的标准曲线、重复性、检出限定量线如表2所示，线性相关性好(R2≥0.9990).每个混标重复测试6次，测得相对标准偏差(S)范围为0.654 μg·mL-1～0.982 μg·mL-1.

通过配制本底含量标准品浓度溶液，加入定浓度的标准品，HPLC检测，获得标准品的加标回收率为98.58%～102.01%，相对标准偏差为1.06%～3.01%，如表3.

表2 标准曲线、重复性及检测限Tab.2 Regression equation，correlation coefficient and detection limit

注:A为峰面积，单位mAU;y为浓度，单位μg·mL-1.

表3 标准品的回收率(means±SD，n=6)Tab.3 Recovery rate of standard substance

利用HPLC外标法检测显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮各组分的含量：二氢杨梅素(18.57%)、杨梅苷(0.53%)、杨梅素(1.29%)、花旗松素(1.38%)、槲皮素(0.51%)、三叶豆苷(0.78%)、山柰酚(0.45%)，加标回收率为97.55%～102.51%，相对标准偏差为2.7%～5.80%(如表4).

2.3显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮抗菌活性

利川显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、溶藻弧菌4株供试菌有中度敏感抑制活性(抑菌圈为11～15 mm)，其MIC值为1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1.对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌2株供试菌有轻度敏感抑制活性(抑菌圈<11 mm)，其MIC值为4.0 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1.显齿蛇葡萄是重要的药食同源饮品，其对6株供试菌的抑菌活性功能为开发显齿蛇葡萄功能性饮品提供了重要参考.

表4 显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮各组分含量表( means±SD，n=6)Tab.4 contents of flavones of the totalflavonoids in the tender leaves of vine tea

表5 显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮的抗菌活性( means±SD，n=3)Tab.5 Antibacterial activity of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

续表5

3结 论

通过质谱数据和紫外吸收光谱，从利川显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮中鉴出7个黄酮类组分：二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素、花旗松素、槲皮素、山柰酚、三叶豆苷.利川显齿蛇葡萄嫩叶总黄酮对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌有中度敏感抑制活性，推测其良好抑菌活性、广谱性与各活性黄酮组分的种类、含量密切相关，是多种活性黄酮组分共同作用的结果.已有研究数据表明在显齿蛇葡萄总黄酮组分中：二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用；杨梅素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌作用；花旗松素对MRSA有抑菌作用；山柰酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有抑菌作用；杨梅苷对MRSA有抑菌作用[21].富含多种黄酮活性组分的显齿蛇葡萄总黄酮提取物，具有良好抑菌活性，在植物源绿色抑菌制剂开发领域具有良好的市场前景.