运用正交试验法优化褐黄木耳母种培养基的配方研究

聂建军 潘保华 李彩萍 牛 宇 徐全飞 冯婉君 蒙秋霞

运用正交试验法优化褐黄木耳母种培养基的配方研究

聂建军1潘保华1李彩萍1牛 宇1徐全飞1冯婉君1蒙秋霞2

（1. 山西省农业科学院农业资源与经济研究所，太原 030006；2. 山西省农业科学院农业环境与资源研究所，太原 030006）

为筛选优化褐黄木耳母种培养基配方，以菌丝日均长速为测量指标，菌丝长势为参考项，通过单因素试验，筛选出母种培养基最佳碳源和最佳氮源，并运用正交试验法优化配方。结果表明，褐黄木耳母种培养基最佳配方为蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂2%，pH自然。利用该配方培养，褐黄木耳菌丝色白、密实，平均生长速度3.82 mm/d，高于正交试验和单因素试验结果。

褐黄木耳；正交试验；母种培养基；配方；优化

褐黄木耳[(Mont.) Fari]隶属担子菌门、层菌纲、木耳目、木耳科、木耳属。夏、秋季发生在槭、桦、栎等多种阔叶树倒木上，单生或群生。子实体较小，平伏耳片状，平滑或稍有脉状皱纹，初期为柔软的胶质，有弹性，后略呈软骨质，光照强时呈琥珀红色或浅紫红色，光照弱时色泽浅，呈褐黄色或粉黄色，薄而透明，干后色变深，呈棕褐色，强烈收缩呈硬而脆的角质至近革质（图1）。子实层生于下表面，背面被绒毛，污白色至淡黄褐色。子实体质地嫩滑，具有降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗癌、抗细胞突变等多种功效，极具开发利用价值[1]。

图1 野生褐黄木耳

褐黄木耳驯化和人工栽培技术的研究日益受到重视，但其母种培养基的筛选尚未见报道。本试验初步筛选出母种培养基最佳碳源和最佳氮源，并利用正交试验进行配方优化，结果如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生褐黄木耳子实体薄，采用耳木分离方法[2]。取长有野生木耳的耳木，锯成3 cm厚的短木片，在接种室内，将木片外表用火轻轻灼烧，杀死表面杂菌，用灭菌的刀片切去木片表皮层，取一小块长有木耳菌丝的心材，移入PDA培养基试管中，接种的试管放于22～25 ℃、暗光、通气良好的培养室中培养，挑选菌丝浓密、色泽白、生长整齐的优良菌株作为供试菌株。

1.2 培养基配方

①马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基[3]：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。

②综合马铃薯葡萄糖（CPDA）培养基[4]：马铃薯20%，葡萄糖2%，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，琼脂2%。

③碳源供试培养基：蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，琼脂2%，pH自然。

④氮源供试培养基：葡萄糖 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，琼脂2%，pH自然。

1.3 试验方法

（1）菌种活化。将褐黄木耳菌种从冰箱中取出后，25 ℃下恒温放置3天，在无菌条件下把活化菌种接种于PDA斜面培养基上，25 ℃下恒温培养2～3天后挑取强壮菌丝前端，转接于CPDA平皿培养基上，25 ℃下恒温培养至表面长满菌丝，作为试验用菌种，备用。

（2）碳（氮）源筛选试验。将葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉5种碳源分别加入碳源供试培养基中（浓度均为2%），进行碳源筛选试验；将蛋白胨、酵母浸膏、尿素、硝酸铵、硫酸铵5种氮源分别加入氮源供试培养基中（浓度均为0.5%），进行氮源筛选试验。每种碳（氮）源平皿培养基试验重复6次，结果取平均值。

无菌条件下，用经灭菌的打孔器（直径5 mm）均匀截取经活化的褐黄木耳菌种，分别接种于直径为9 cm的不同碳（氮）源平皿培养基（溶化的培养基约25 mL）中央，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，3天后开始观察菌丝生长情况，并采用十字交叉法测量菌落直径，记录菌丝长势，连续观测记录10天。

（3）正交试验优化母种培养基配方。根据碳、氮源单因素试验结果，把筛选出的最佳碳源、最佳氮源和无机盐KH2PO4、MgSO4·7H2O 组成正交试验9个不同处理的培养基，采用4因素3水平正交试验法，优化出褐黄木耳母种培养基最佳配方。

用经灭菌的直径5 mm打孔器均匀截取经活化的褐黄木耳菌丝体组织块，在无菌条件下分别接种于正交试验9个不同处理的直径为9 cm的平皿培养基（溶化的培养基约25 mL）中央，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养。3天后开始连续10天观察菌丝生长情况，并以接种块为中心用十字交叉法测量菌落直径（mm），随机测量3 次，结果取平均值[5]，同时记录菌丝长势。

菌丝日均长速计算公式：= [(–5)/2]/。

式中：表示菌落直径（mm），表示培养时间（d）。各试验因素及其水平见表1。

表1 L9(34)正交实验的因素和水平设计（%）

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS16.0软件进行分析，多重比较采用邓肯新复极差检验法（Duncan′s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2 结果与分析

2.1 碳源筛选结果

由表2可以看出，在相同培养时间和培养条件下，以蔗糖作为碳源的菌丝平均长速较快，为2.92 mm/d，与其他4种碳源差异达极显著水准。菌丝色白、密实。综合比较，选择蔗糖作为褐黄木耳母种培养基的最佳碳源。

表2 不同碳源和氮源的菌丝平均长速和菌丝长势

注：①同列数据后小写英文字母和大写英文字母分别表示Duncan多重比较法检测结果差异显著性（=0.05，=0.01）；②致密、密实、细密、稀疏表示菌丝长势依次减弱；③淀粉为可溶性淀粉。

2.2 氮源筛选结果

由表2可以看出，在相同培养时间和培养条件下，以酵母浸膏为氮源的培养基菌丝平均长速较快，为2.85 mm/d，与其他4种氮源差异达极显著水准。菌丝色白、密实。综合比较，选择酵母浸膏作为褐黄木耳母种培养基的最佳氮源。

2.3 正交试验优化褐黄木耳母种培养基配方结果

从L9(34) 正交实验结果与极差分析结果（表3）可知，影响褐黄木耳母种培养基配方的因素依次为（B）酵母浸膏>（A）蔗糖>（C）KH2PO4>（D）MgSO4·7H2O；褐黄木耳母种培养基最佳配方组合为A1B1C3D3，即最佳配方为蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂2%，pH自然。

表3 培养基配方正交试验结果

2.4 最佳配方验证试验

对正交试验结果所得的最佳配方（蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂2%，pH自然）进行6次重复试验验证，结果显示，在其他条件相同情况下，利用该配方培养，菌丝均色白、密实，菌丝平均长速分别为3.86、3.78、3.91、3.85、3.72及3.81 mm/d，平均值3.82 mm/d，高于正交试验和单因素试验的每组结果。

3 结 论

碳源不仅是褐黄木耳合成菌体细胞必不可少的原料，也是其生命活动的能量来源，氮源则是合成蛋白质和核酸的重要原料。褐黄木耳的生长发育还需要一定的无机盐类，其中以磷、钾、镁3种元素尤为重要[6]。

通过单因素试验发现，褐黄木耳母种培养基的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母浸膏。运用正交实验法优化褐黄木耳母种培养基配方，结果最佳配方为蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂2%，pH自然。

本研究是在筛选出褐黄木耳母种培养基单一碳源和氮源的基础上进行的，关于选用复合碳源和氮源对母种培养基配方进行优化，其菌丝生长特性有无改变，驯化栽培产量是否受影响，有待进一步研究探讨。

[1] 潘保华, 聂建军, 徐全飞, 等. 山西大型真菌野生资源图谱[M]. 北京: 科学技术文献出版社, 2018.

[2] 兰进, 陈向东, 曾念开. 名贵药用真菌栽培技术问答[M]. 北京: 化学工业出版社, 2014.

[3] 田梦媛, 高原, 杜双田, 等. 27个香菇菌株农艺性状比较研究[J]. 中国农业大学学报, 2019, 24(1): 82-91.

[4] 陈立佼, 柴红梅, 黄兴奇, 等. 尖顶羊肚菌单孢菌株群体培养特性研究[J]. 生物技术, 2011, 21(6): 63-70.

[5] 刘娜, 宋莹, 吕立涛, 等. 5株梯棱羊肚菌菌丝生长特性研究[J]. 中国食用菌, 2019, 38(9): 21-28.

[6] 方芳, 宋金娣, 冯吉庆, 等. 食用菌生产大全[M]. 南京: 江苏科学技术出版社, 2007.

Optimum of stock culture medium formula ofby orthogonal test

Nie Jianjun1Pan Baohua1Li Caiping1Niu Yu1Xu Quanfei1Feng Wanjun1Meng Qiuxia2

（1.Institute of Agricultural Resources & Economy, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China；2. Institute of Agricultural Environment & Resources , Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China）

Taking the average daily growth rate of hypha as the measurement index and hypha growth potential as the reference item, the best carbon source and the best nitrogen source ofstock culture medium were selected through single factor experiment, and the formula of stock culture medium was optimized by orthogonal test. The results showed that the optimal formula of stock culture medium forwas: sucrose 2%, yeast extract 0.5%, KH2PO40.3%, MgSO4·7H2O 0.15%, agar 2%, and natural pH.

; orthogonal test; stock culture medium; formula; optimization

S646

B

2095-0934（2020）05-318-04

山西省农业科学院山西“农谷”研发专项资助项目（YCX2018204）；山西省农业科学院农业科技成果转化与示范推广资助项目（2019CGZH07-2）；山西省重点研发计划（农业）资助项目（201803D221011-1）；山西省重点研发计划资助项目（201903D221046）

聂建军（1969—），男，副研究员，现主要从事食药用菌等研究工作。E-mail：njjj666@126.com。