维生素D受体基因多态性与青少年结核易感性的研究

沙玉霞，张 雪，周浩泉，王 华，何金根，周 玲，张慧芳，李 丹，张亚芥，母东勤，潘家华，肖 红

由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的肺结核病(pulmonary tuberculosis, PTB)仍然是最紧迫的健康问题之一。先天性免疫在PTB的病理生理中起着重要作用，其中维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)基因多态性可通过降低免疫细胞抗菌肽的表达水平及其自噬能力影响宿主对Mtb的防御，进而影响PTB进程[1-2]。基因-环境间的相互作用影响VDR基因多态性与PTB关联结果的一致性[1,3]。相较于成人所处社会环境的复杂及基因突变的累积，青少年所处环境较为单一，生活习性相近，研究该群体利于分析VDR基因多态性对PTB易感的影响。且近年来青少年PTB起病隐匿，痰涂片阳性率低，治疗依从性差，耐药率高。故该研究通过对VDR基因多态性与青少年PTB易感进行相关性分析，为青少年PTB诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2018年2月～2019年10月就诊于安徽医科大学附属省立医院及西藏自治区山南市人民医院感染科并确诊为活动性肺结核病青少年96例为病例组。纳入标准：① 所有肺结核病例的诊断在流行病学、临床症状、体征、胸部影像学表现、实验室检查等方面均严格遵守《肺结核诊断标准(WS288-2017)》[4]确诊原则；② 获取患儿或其监护人书面知情；③ 入组对象依从性良好。排除标准：排除合并有其他部位结核灶、乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或需激素治疗的患者。选取同期在山南市及合肥市进行健康体检的青少年123例作为对照组。纳入标准：① 结核病症状筛查阴性，PPD试验及胸片拍摄均阴性，并结合其他辅助检测方法随访跟踪1年后均未提示结核感染；② 获取患儿或其监护人书面知情；③ 入组对象依从性良好。排除标准：排除患有乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或需激素治疗的患者。本研究经安徽省立医院、山南市人民医院伦理委员会审核通过。

1.2 血标本的采集采集所有研究对象外周静脉血2 ml,3 000 r/min离心10 min，将血清及血块分开，并置于EP管中，在-20 ℃条件下存放，集齐后进行检测。

1.3 VDR基因多态性检测

1.3.1血液DNA的提取 使用血凝块基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood Clot DNA Kit, DP335)提取基因组DNA，并通过核酸凝胶电泳检测DNA浓度，保证浓度约100 ng/μl，将DNA提取物置于-20 ℃环境下保存。

1.3.2PCR扩增目的基因 PCR扩增目的基因步骤概述如下。① 设计引物：由通用生物系统有限公司合成引物，引物序列：ApaI上游5′-GGACAGGGAG CAAGGCCAGG-3′，下游3′-GGCTGGAAGGAGAGGC AGCG-5′；BsmI上游5′-GGCCAGCTGGGCAACCTGA A-3′，下游3′-CCAGCGGAAGAGGTC-AAGGGT-5′；FokI上游5′-TGAGGGCTCCGAAGGCACTG-3′，下游3′-GAGAGCCTGGGAGGAGGG-CT-5′；TaqI上游5′-CTGGAGGGCTTTGGGGCC-AG-3′，下游3′-GGCTGGAAGGAGAGGCAGCG-5′。② 建立PCR体系：基因组DNA(约100 ng/μl)2 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI正向引物1 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI反向引物1 μl、2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μl、ddH2O 21 μl，合计50 μl。③ 将配制好的PCR反应体系放入PCR仪进行聚合酶链式反应扩增，循环条件及过程：在94 ℃环境下预变性5 min；30个PCR循环(94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)；最后在72 ℃条件下延伸10 min；将扩增产物置于4 ℃环境中保存。

1.3.3VDR基因多态性检测 目的序列扩增成功后，以对应限制性内切酶进行酶切。酶切体系：酶切片段(约500 ng)10 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性内切酶(NEB北京)1 μl、10×Cutsmart 2 μl、ddH2O 7 μl，合计20 μl。配制好的酶切体系放入PCR仪进行酶切，在37 ℃环境下酶切8 h。 酶切结束后，取酶切产物20 μl进行检测，以100 bp DNA Marker作为参照，2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察酶切结果，拍照并记录。

1.4 统计学处理采用SPSS 22.0统计软件包进行数据分析。病例组与对照组间的定量资料、非正态分布者采用非参数检验；计数资料(性别、基因型分布频率)采用χ2检验；通过计算比值比(Odds Ratio,OR)和95%可信区间(confidence interval,CI)分析青少年PTB易感基因型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料合肥市病例组纳入40例，男性22例(55.0%)，女性18例(45.0%)；对照组纳入40例，男性21例(52.5%)，女性19例(47.5%)。山南市病例组纳入56例，男性30例(53.6%)，女性26例(46.4%)；对照组纳入83例，男性43例(51.8%)，女性40例(48.2%)。各组青少年年龄范围均为13～19岁，中位年龄均为17岁。经检验，病例组与对照组间一般人口学资料差异无统计学意义。

2.2 各位点PCR产物及酶切产物四个多态性位点显性等位基因A/B/F/T分别无ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性内切酶切割位点，而隐性等位基因a/b/f/t分别具有ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性内切酶切割位点。VDR基因四个位点的PCR产物及酶切产物的凝胶电泳后紫外下成像，分别对应：① ApaI位点，PCR产物为453 bp，ApaI限制性内切酶酶切后产生AA(显示1条453 bp的片段)、Aa(显示453/204/249 bp的3个片段)、aa(显示204/249 bp的2个片段)3种基因型；② BsmI位点，PCR产物为386 bp，BsmI限制性内切酶酶切后产生BB(显示1条386 bp的片段)、Bb(显示386/211/175 bp的3个片段)、bb(显示211/175 bp的2个片段)3种基因型；③ FokI位点，PCR产物为353 bp，FokI限制性内切酶酶切后产生FF(显示1条353 bp的片段)、Ff(显示353/262/91 bp的3个片段)、ff(显示262/91 bp的2个片段)3种基因型;④ TaqI位点：PCR产物为367 bp，TaqI限制性内切酶酶切后分TT(显示1条367 bp的片段)、Tt(显示367/243/124 bp的3个片段)、tt(显示243/124bp的2个片段)3种基因型。见图1。

2.3 合肥市青少年基因型分布频率分析病例组VDR-BsmI位点BB、Bb、bb基因型与对照组相应基因型比较，差异有统计学意义(χ2=19.948,P<0.001)；病例组FokI位点FF、Ff、ff基因型与对照组相应基因型比较，差异有统计学意义(χ2=7.231,P=0.027)。病例组TaqI、ApaI位点基因型与对照组相应基因型比较，差异无统计学意义(χ2=0.503,P=0.778；χ2=0.978,P=0.613)，见表1。

2.4 山南市青少年基因型分布频率分析病例组VDR-BsmI位点3种基因型BB、Bb、bb与对照组相应基因型比较，差异有统计学意义(χ2=38.485,P<0.001)；病例组FokI位点FF、Ff、ff基因型与对照组相应基因型比较，差异有统计学意义(χ2=21.781,P<0.001)。病例组TaqI、ApaI位点基因型与对照组相应基因型比较，差异无统计学意义(χ2=3.020,P=0.221；χ2=0.166,P=0.920)，见表2。

3 讨论

Mtb感染时，单核细胞Toll样受体被激活，上调VDR和1α-羟化酶，扩大维生素D与VDR结合后先天免疫效应，限制胞内Mtb的生长。PTB是由Mtb引起的一种受基因调控的传染病，人类遗传变异是Mtb感染结果的重要决定因素之一[5]，然而关于VDR基因变异对PTB患者的临床影响尚未完全阐明。相较于青少年，小年龄儿童散居、营养好、压力小、受卡介苗保护、PTB自愈率高；且青少年相对简单的生活环境不易混淆VDR基因变异与PTB的关联。故探讨VDR基因多态性与青少年PTB易感性间的关联，研究结果具有一定的普遍性。

图1 ApaI、BsmI、FokI、TaqI位点PCR产物及酶切产物凝胶电泳结果

本研究采用同一技术同时对两地区青少年进行基因型分析，结果显示BsmI位点Bb、bb基因型同时为两地区青少年肺结核病易感基因型(P<0.05)。可见虽然位于VDR基因3′端第Ⅷ内含子中的BsmI位点多态性对VDR的氨基酸结构没有影响，但其可能参与调节mRNA的稳定性[6]或与其他功能基因位点存在连锁不平衡调控VDR基因表达[7]，从而影响PTB进程。而在台湾地区[7]的研究仅表明Bb基因型增加结核易感性，可能由于研究对象年龄范围有别于本研究，故需更多青少年的相关研究来证实本研究结论。

表1 合肥市青少年基因型分布频率及结核易感基因型[n(%)]

表2 山南市青少年基因型分布频率及结核易感基因型[n(%)]

该研究表明两地区携带Ff、ff突变基因型青少年患PTB风险均显著增加(P<0.05)。由于位于第Ⅱ外显子上的FokI变异体可改变氨基酸序列长度，影响mRNA的表达水平[8]，f突变基因降低VDR基因转录速率，减少VDR蛋白含量[9]，减弱杀菌效能。然而在上海的研究仅显示Ff增加PTB患病风险[10]，更有在四川[11]及台湾地区[7]的相关成人研究中并未发现任何关联，较本研究，在四川的成人研究纳入重症病例比例较高；在台湾地区的成人研究纳入男女比例相对失衡。

综上，该位点多样性可能为功能位点，受环境、年龄组别、病情严重程度、性别等影响；也可能与其他基因位点存在连锁不平衡，故研究者将着眼于环境与基因间交互作用，完善研究设计，更好地阐明该位点多态性影响PTB易感性的机制。此外，北京胸科医院得出ff基因型及低下的维生素D水平增加PTB发病风险[3]，而北京儿童医院却未得出任何关联，可见同一地区不同年龄组别下隐含的差异较大。该研究对象是合肥市及山南市青少年，故尚需证明VDR基因多态性与其他地区青少年PTB易感间的关联是否与本研究一致。

本研究显示VDR基因ApaI位点多态性与青少年PTB易感无关，与国内外相关研究[7,9]结论一致。由于位于第Ⅷ内含子上的ApaI位点多态性不影响VDR的氨基酸序列[10]，可能与TB易感无关。该研究表明TaqI变异体与青少年PTB易感亦无关，与在墨西哥的研究[9]结论一致，但与印度不同地区的研究[12-13]结论却不一致。可见虽然TaqI多态性是由同义突变造成，不会改变氨基酸序列，但可能影响mRNA稳定性和蛋白质翻译效率[7]；也可能存在基因-环境交互作用混淆了TaqI多态性与PTB易感的关系。

通过对VDR基因多态性与青少年PTB易感性分析表明BsmI及FokI位点多态性与青少年PTB易感有关；为更好地了解调节VDR的3个主要因素——环境、基因和表观遗传学，有必要进行重复性、多中心、大样本研究，以得出更科学的结论，为结核病防治提供理论依据。