三七多糖含量测定方法比较

2020-10-12蔡群虎刘石磊袁敏惠王芬胡会泽张芳盛郭霞刘晓丽辛文锋

云南中医中药杂志 2020年8期

蔡群虎刘石磊袁敏惠王芬胡会泽张芳盛郭霞刘晓丽辛文锋

摘要：目的通过比较硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在测定三七多糖时的优劣性，建立更准确的三七多糖含量测定检测方法，为三七、三七剪口的多糖质量评价提供依据。方法依次用80%乙醇和纯水提取三七药材，水提部分得到三七多糖，对所得多糖采用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法分别测量三七粗多糖的含量。结果从精密度的角度来看，苯酚硫酸法较蒽酮硫酸法可靠（RSD=0.419<3.66）。从回收率的角度来看，使用苯酚硫酸法测定时，回收率更高（98.06>97.60）。结论苯酚硫酸法为更准确测定三七粗多糖含量的检测方法，此外，苯酚硫酸法还具有操作更简便、安全、快捷等优点。

关键词：三七粗多糖;硫酸苯酚法;硫酸蒽酮法;含量测定

中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）08-0059-04

【Abstract】Objective： To establish a more accurate method for the determination and detection of notoginseng polysaccharide content by comparing the pros and cons of the sulfuric phenol method and the anthrone sulfate method in the determination of notoginseng polysaccharides and provide an evaluation basis for the quality of polysaccharides in notoginseng and notoginseng snip. Methods： The medicinal materials of Panax notoginseng were extracted with 80% ethanol and pure water in sequence， and the polysaccharides of Panax notoginseng were obtained by water extraction. The content of crude polysaccharides of Panax notoginseng was measured by the sulfuric acid-phenol method and the sulfuric acid-anthrone method. Results： From a precision point of view， the phenol sulfuric acid method was more reliable than the anthrone sulfuric acid method （RSD=0.419<3.66）. From the perspective of recovery rate， the recovery rate is higher when the phenol sulfuric acid method was used for determination （98.06>97.60）. Conclusion： The phenol-sulfuric acid method is a more accurate method to determine the content of the crude polysaccharides of Panax notoginseng. In addition， the phenol-sulfuric acid method is easier to operate， and safer and faster.

【Key words】crude polysaccharide of Panax notoginseng， phenol sulfate method， anthrone sulfate method， content determination

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]，为五加科人参属多年生草本植物，主要药用部位为根部，产地主要为云南文山，广西等地[1]。三七为我国的传统名贵中药材，主要用于治疗外伤出血、咯血、吐血、便血、胸腹刺痛、跌打肿痛等[2]。三七皂苷为三七的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫力、保護心血管、保肝保肾等药理作用[3]。三七多糖是三七另一个活性成分，在药材中含量为6%-10%左右[4]，无毒副作用[5]，药理研究表明三七多糖具有增强机体免疫力的作用，具有一定的开发价值。为此本文对三七中的多糖提取物进行了含量测定，比较了硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在测定三七多糖时的优劣性，为建立更准确的三七多糖含量测定方法和质量评价提供了参考依据。

1 材料、仪器和试剂

1.1 材料与试剂材料：三七剪口皂苷提取后药渣干品所制得粗多糖（云科药业和云南三七科技有限公司技术中心提供）;

试剂：无水乙醇、苯酚、浓硫酸、蒽酮（以上试剂均为分析纯）;

标准曲线所用标准品：葡萄糖

1.2 仪器与设备万能粉碎机;电子天平（梅特勒）;电热恒温鼓风干燥箱（矛华DHG-9420）;HH-4数显恒温水浴锅;型循环水真空泵;RE-2000A型旋转蒸发仪;超声波清洗器;紫外可见分光光度计（日历）;双光束紫外可见分光光度计（上海驰唐实业有限公司）;离心机（上海恒平）;真空干燥箱（玛瑞特）。

2 方法与结果

2.1 苯酚硫酸法测定三七多糖含量

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取0.0100 g单糖标准品，置于50 mL烧杯中，用超纯水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得对照品溶液。

2.1.2 三七粗多糖制备精密称取三七剪口粗粉10 g于500 mL圆底烧瓶中，加入80%的乙醇200 mL回流提取2 h，弃过滤液，药渣再加入80%的乙醇200 mL回流提取1.5 h，弃过滤液，收集药渣。将药渣于60℃鼓风干燥箱挥干乙醇，加入纯水热回流提取2次，每次加入纯水200 mL，每次提取2 h，合并两次提取液，旋转蒸真空浓缩到50 mL，搅拌加入400 mL无水乙醇醇沉8 h，过滤取沉淀，冷冻干燥得三七粗多糖。

2.1.3 三七粗多糖样液的制备精密称取0.3 g粉碎后的三七粗多糖样品于250 mL三角瓶中，向三角瓶中加入220 mL蒸馏水，加盖保鲜膜，80℃水浴回流加热2h，然后进行药棉自然过滤，并将滤液转入250 mL容量瓶中;将滤渣连同药棉一同转入烧杯中，加入20 mL蒸馏水，80℃水浴1 h，之后抽滤，合并两次滤液，定容至250 mL容量瓶中。从容量瓶中取2 mL液体于烧杯中，加入无水乙醇10 mL使含醇量达到80%，冷藏1h，有沉淀析出，过滤收集沉淀，沉淀用水溶解25 mL定容，摇匀，即制得样液。

2.1.4 3%苯酚溶液的配制称取3.0 g重蒸苯酚，加入96 mL超纯水，于棕色瓶中，置于冰箱保存。

2.1.5 供试液的配制准确吸取1 mL的“2.1.3”项下的多糖样液，再加入“2.1.4”项下1 mL苯酚，4 mL浓硫酸，摇匀，反应10 min后，用冰水浴迅速冷却至室温，即得供试液。

2.1.6 标准曲线的绘制准确吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL标准溶液于具塞试管中，加水补足1 mL，按“2.1.5”项下方法操作，在490 nm处测定其吸收值，以吸光度A为纵坐标，标准溶液浓度ρ为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=13.333ρ-0.0229，R^2=0.9985，线性范围为0.011～0.074 mg/mL。

2.1.7 精密度试验精密吸取三七粗多糖样液1 mL，按“2.1.5”项下方法操作，在490 nm波长处测定吸收值，重复测定6次，相对标准偏差RSD为0.419%，结果见表1。

2.1.8 稳定性试验精密称取三七粗多糖0.3 g，按“2.1.3”、“2.1.5”项下方法制备供试液，分别在10、20、30、40、50、60 min测定吸光度。相对标准偏差RSD为0.09%，表明加入苯酚、硫酸的供试溶液在60 min内稳定。结果见表2。

2.1.9 回收率试验精密吸取0.3 mL三七粗多糖样液三份，分别加入0.1、0.2、0.3 mL标准溶液，按“2.1.5”项下方法操作，在490 nm处测定其吸光度，按公式计算加样回收率，平均回收率98.06%，RSD=1.19%，所得结果见表3。

2.1.10 三七粗多糖的含量测定精密吸取1 mL“2.1.3”项下样液于具塞试管中，按“2.1.5”项下方法操作，在490 nm处测定其吸光度，根据吸光度从回归方程求出样品的含量，该批三七粗多糖平均含量是30.22%，RSD=0.7827%，结果见表4。

2.2 蒽酮硫酸法测定三七粗多糖含量

2.2.1 对照品溶液的制备按“2.1.1”操作，即得对照品溶液。

2.2.2 三七粗多糖样液的制备按“2.1.2”“2.1.3”项操作，即得供试样液。

2.2.3 蒽酮硫酸的配制称取0.33 g蒽酮，加100 mL浓硫酸，摇匀，置于棕色瓶中保存。

2.2.4 供试溶液的配制准确吸取1 mL的“2.2.2”项下的多糖样液，再加入“2.2.3”项下的4 mL蒽酮硫酸，快速置于冰水浴中摇匀，然后置于沸水浴中加热10min，观察颜色变化，之后用冰水浴迅速冷却至室温，即得供试液。

2.2.5 标准曲线的绘制准确吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL标准溶液于具塞试管中，加水补足1 mL，按“2.2.4”项下方法操作，在620 nm处测定其吸收值，以吸光度A为纵坐标，标准溶液浓度ρ为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=5.1337ρ-0.0430，R^2=0.9994，線性范围是0.013～0.098 mg/mL。

2.2.6 精密度试验精密吸取粗多糖样液1 mL，按“2.2.4”项下方法操作，在620 nm处测定其吸收值，重复测定6次，相对标准偏差RSD为3.66%，结果见表5。

2.2.7 稳定性试验精密称取三七粗多糖0.3 g，按“2.2.2”、“2.2.4”项下方法操作，分别在10、20、30、40、50、60 min测定吸光度。相对标准偏差RSD为0.073%，表明加入蒽酮、硫酸的供试溶液在60 min内稳定，结果见表6。

2.2.8 回收率试验精密量取0.3 mL供试液三份，分别加入0.1、0.2、0.3 mL标准溶液，加水补足1 mL，按“2.2.4”项下方法操作，在620 nm处测定其吸光度，按公式计算加样回收率，平均回收率为97.6%，RSD=0.95%，结果见表7。

2.2.9 三七粗多糖的含量测定精密吸取1 mL“2.2.2”项下样液于具塞试管中。按“2.2.4” 项下方法操作，在波长为620 nm处测定吸光度，根据吸光度从回归方程求出三七粗多糖的含量是29.77%，RSD=1.17%，结果见表8。

3 讨论

实验开展了对三七废弃物的综合利用研究，从废弃物中提取三七多糖。三七粗多糖含量的测定方法一般有比色法、3-5-二硝基水杨酸比色法以及傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合支持向量机回归硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸（SVR）法[6]，课题组用两种便于生产企业常用的硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸法测定了三七粗多糖含量;比较了苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法在測定三七多糖含量中的优劣。对于三七粗多糖，比较表1和表5可知：从稳定性来看，苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法均适合于三七粗多糖含量的测定。比较表2和表6可知：从精密度的角度来看，苯酚硫酸法较蒽酮硫酸法可靠。比较表3和表7可知：从加标回收实验结果来看，使用苯酚硫酸法测定时，回收率更高。因此，苯酚硫酸法较之蒽酮硫酸法，操作更简便、安全、快捷。因此，选用苯酚硫酸法测定三七粗多糖含量较优。

三七多糖单糖组分结构复杂，文献一级表征结构表明三七多糖主要由葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖组成[7]，实际实验分析和生产检测中发现，对三七粗多糖进行微孔滤膜截留得到不同段次三七多糖，分子量大的3～5万，分子量小的几千[8-9]，经过检测发现，分子量小的多糖以葡萄糖为对照，测定则多糖含量非常低，薄层鉴别发现、乳糖，阿拉伯糖点非常浓。同样的对粗多糖进行脱蛋白、脱淀粉、脱氨基酸、脱盐处理后含量也仅仅能达到70%～80%左右，由此可知由于三七多糖单糖组分的复杂性，选择单一葡萄糖为对照，采用广谱的紫外分关光度法测定，仍然具有一定的极限性，还有很多工作要做。

三七多糖含量测定方法研究有利于三七多糖质量标准的完善，对进一步深入研究我国特有三七资源、提高其附加值、增加种植户收入做出积极贡献，具有较好的经济和社会效益，也可给人们提供新的保健品，为人类健康做出贡献。

参考文献：

[1]徐冬英.三七名称及其有文字记载时间的考证[J].广西中医学院学报，2000，17（3）：91.

[2]刘东平，杨军，丁丹.三七及其有效成分对血液系统的药理活性研究概况[J].中医药息，2012，29（4）：172-174.

[3]李青融，王子妤.三七总皂苷药理作用的研究进展[J].湖南中医杂志，2017，33（9）：216-218.

[4]熊艺花，李婧，黄松，等.DNS法对三七总多糖含量测定[J].亚太传统医药，2011，7（7）：7-9.

[5]王华晶，秦华炎，李怀宇，等.三七多糖的安全性评价[J].云南中医中药杂志，2017，38（12）：56-60.

[6]李运，张霁，刘飞，等.FTIR结合SVR对三七总多糖含量快速预测[J].光谱学与光谱分析，2018，38（6）：1696-1701.

[7]倪力军，王媛媛，何婉瑛，等.8种多糖的单糖组成、活性及其相关性分析[J].天津大学学报（自然科学与工程技术版），2014，47（4）：326-330.

[8]沈志伟，龚云麒，李莹.三七多糖的新研究进展[J].临床医药文献电子杂志，2018，5（58）：194-196.

[9]陈为，吕士杰.三七多糖的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009，30（2）：106-110.

[10]刘岩，范开，李龙军，等.三七多糖的含量测定方法及不同部位多糖的含量变化研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（19）：118-120.