胭脂素联合TRAIL对非小细胞肺癌细胞生长和转移的抑制作用

赵海鹏 张珍珍

(1华北电力大学医院外科，北京 102206；2潍坊市人民医院呼吸内科)

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研究表明85%的患者为非小细胞肺癌，而化疗是治疗非小细胞肺癌的主要方法，但是化疗后肿瘤缓解率为40%～50%，并且化疗常伴随部分患者出现耐药性及全身系统副作用，探索治疗肺癌的新策略至关重要〔1〕。胭脂素又称胭脂树橙、红木素，是一种在胭脂树红中发现的脱辅基类胡萝卜素，既往研究表明该药物不仅可减少炎症反应和氧化损伤从而预防动脉粥样硬化，而且可通过诱导凋亡和阻滞细胞周期抑制肿瘤细胞的增殖〔2〕。因为胭脂素可通过抗增殖和诱导凋亡来抑制各种癌细胞的生长，本研究探讨胭脂素和TRATL联合用药对非小细胞肺癌的治疗作用。

1 材料和方法

1.1细胞培养与处理 从美国典型培养物保藏中心(ATCC，USA)购买肺癌细胞系A549和H460，以及BEAS-2B的人正常肺上皮细胞。常规培养的所有细胞在含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)，1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco，Waltham，MA，USA)中进行培养。用于人类肺癌治疗的胭脂素(纯度> 98%，美国，Sigma)溶于DMSO中，并保存在-20℃进行后续研究，然后在DMEM培养基中稀释以进行实验治疗。

1.2细胞活力分析 为了计算胭脂素、TRAIL这两种药物在不同细胞系中的抑制作用，将约1×103个细胞/孔种植在96孔板中。24 h后，用不同浓度的胭脂素处理癌细胞，并在37℃下孵育24 h。最终通过噻唑蓝(MTT)测定法评估细胞活力。药物分组为：A组(0 μmol/L胭脂素)、B组(40 μmol/L脂胭素)、C组(80 μmol/L胭脂素)、D组(100 ng/ml TRAIL)、E组(200 ng/ml TRAIL)、F组(40 μmol/L 胭脂素+100 ng/ml TRAIL)。

1.3成克隆实验 用指定浓度的胭脂素和TRAIL在生长培养基中处理约65%的人肺癌细胞24 h。 孵育后，将细胞收集在单独的试管中。 从每个试管中，分别在6孔板中铺600个细胞/孔，并使其生长2 w。14 h后，将细胞用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，使用冷却的甲醇固定细胞15 min。然后在室温下，将细胞在25%甲醇中的0.5%结晶紫溶液(ChemCatch，美国)染色5 min。将细胞用水洗涤3次并风干以使用显微镜计数。

1.4划痕实验 先用马克笔在6孔板背后均匀划横线，再将人肺癌细胞按1×105个细胞/孔种植于6孔板中，待细胞长满后，使用枪头垂直于背后的直线划痕。然后用PBS洗涤以去除细胞碎片，并继续培养24 h。

1.5统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、秩和检验。

2 结 果

2.1胭脂素增强了TRAIL诱导的人类肺癌细胞株活力的抑制 见图1，单独用不同浓度的TRAIL或胭脂素处理的细胞显示出细胞附着减少和明显的细胞收缩，这在人正常的肺上皮细胞中没有发现。但是，TRAIL和胭脂素的联合治疗增强了这种对细胞生长的抑制作用。用TRAIL和胭脂素处理的肺癌细胞的细胞活力要比单一处理的细胞低。正常细胞BEAS-2B在用胭脂素和(或)TRAIL处理后，各组之间无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 不同药物组对各细胞株活力的影响值)

图1 肺癌细胞活力检测(MTT，×40)

2.2胭脂素和TRAIL联合抑制人肺癌细胞系中的集落形成和迁移 如图2所示单独用胭脂素或TRAIL处理的肺癌细胞株的集落形成水平以剂量依赖的方式明显减弱。值得注意的是，与单一药物治疗相比，联合治疗促进了肺癌细胞克隆能力的降低(表2)。划痕实验表明，单独使用TRAIL或胭脂素的治疗可适度降低迁移的肺癌细胞的比例。但是联合处理增强了这种效应(图3，表3)。

图2 肺癌细胞集落形成能力检测(结晶紫染色，×40)

表2 药物组对各细胞株集落形成的影响

图3 肺癌细胞迁移能力检测(×40)

表3 各细胞株迁移能力的影响

3 讨 论

据报道，在全世界人类中，肺癌在所有肿瘤中的发病率最高〔3〕。本研究探讨胭脂素对人肺癌进展的影响。胭脂素可用于多种疾病，如肺部损伤、血液系统肿瘤和脑损伤的治疗〔4,5〕。然而，到目前为止，人们关于胭脂素对肺癌的影响知之甚少，尤其是与TRAIL联合使用时。TRAIL是属于TNF家族的成员，可以被DR4和DR5结合，激活细胞凋亡蛋白酶(Caspase)-8裂解。 Caspase-8活性对于Caspase-9表达很重要，随后刺激Caspase-3裂解并诱导细胞凋亡，最终导致细胞死亡〔6〕。在此过程中，抗凋亡分子B细胞淋巴瘤(Bcl-2)被下调，促凋亡成员Bcl-2相关X蛋白(Bax)被上调。此外，TRAIL作为肿瘤抑制因子，已被用作通过凋亡诱导治疗各种癌症的有效药物〔7〕。胭脂素是一种天然的类胡萝卜素，从Bixa Orellana的种子中分离出来〔8〕。类胡萝卜素联蛋白(BX)可减少炎症反应和氧化损伤。研究表明，食用胭脂素可通过减少氧化损伤，炎症反应和血脂异常来预防动脉粥样硬化〔9〕。胭脂素在癌症的进展和发展中发挥抗增殖和凋亡的作用〔10〕。本研究结果表明胭脂素和TRAIL治疗肺癌，特别是两种药物的结合，显著下调了癌细胞的增殖和迁移，这与肿瘤转移密切相关。