黄芩素通过烟酸受体抑制胃癌细胞增殖

花文峰，李婕，严芳，杨华文，张智，曹东林

（广东省第二人民医院，广东 广州 510317，1.医学实验中心；检验医学部）

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国恶性肿瘤中发病率和病死率均仅次于肺癌。最新的肿瘤流行病学统计表明，2015年有67.91万新发胃癌患者和49.8万肿瘤患者死于胃癌[1]。目前，胃癌治疗的手段仍以手术为主，强调综合治疗。但由于胃癌的早期并无明显的症状，多数表现为上腹不适、嗳气等非特异性症状，导致早期的诊断率较低，而错过了最佳的手术时机。胃癌术后的辅助化学治疗是以肿瘤细胞毒性药为主，主要的化疗药物包括抗代谢药、烷化剂、抗生素类以及植物类药[2]。而近年来，研究发现中药作为胃癌术后的辅助用药独具特色，主要以活血理气、解毒消积的方剂为主，结合辨证酌情活用温肾健脾、养阴清热、理气降逆、化瘀软坚、消食导滞等药，以扶助正气，增强脾胃运化功能，使攻中有补、攻补兼施，在改善症状、控制肿瘤生长和延长患者生存方面均取得了较好的效果[3-5]。

中药黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根[6]。黄芩作为我国的传统药物，已有2 000多年的应用历史，其在《神农本草经》中被列为中品，具有“主治诸热，黄疸，肠癖，泄痢，逐水，下血闭，恶疮，疽蚀，火疡”。临床上黄芩既可以单独使用也可以与其他中药配伍，主要用于治疗呼吸道感染、急性菌痢和病毒性肝炎等[6-9]。研究发现，黄芩素（Baicalein）是黄芩中含量较高的黄酮类化合物之一，在体内的药动学研究表明黄芩素在胃肠道易被吸收，且生物利用度高[7，10]。研究发现黄芩素还可以抑制多种肿瘤细胞的生长，特别是在消化系统，黄芩素可以诱导结肠癌和胃癌细胞的凋亡，但其作用的靶点和具体分子机制仍不清楚[11-18]。

G蛋白偶联受体作为体内最大的蛋白质超家族，广泛存在于生物体细胞膜上，其在细胞中的表达或功能失调，与肿瘤的发生、浸润和转移密切相 关[19]。新近研究发现烟酸受体（GPR109A）在结直肠癌和乳腺癌中发挥肿瘤抑制的功能[20-21]。本研究探索黄芩素的抗肿瘤作用是否与调控烟酸受体的表达相关。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：胃癌细胞株（MGC80-3、HGC-27、BGC-823）与人胃黏膜上皮细胞株GES-1由中山大学附属肿瘤医院肿瘤研究所提供。

1.1.2 主要试剂：黄芩素（Catalog No.S2268，美国Selleck公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8，日本Dojindo公司），胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），兔抗GPR109A多克隆抗体（NBP1-92180，1:100；美国Novus公司），兔抗α-Tubulin单克隆抗体（ab24246，1:10 000；美国Abcam公司），山羊抗兔二抗（SA00001-2，1:10 000；美国Proteintech公司），GPR109A表达质粒（美国GeneCopoeia公司），ECL化学发光液、Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAi MAX（美国Thermo Fisher Scientific公司），GPR109A siRNA序列及阴性对照siNC（广州Ribobio 公司），Transwell小室和基质胶（美国Becton Dickinson公司）。

1.1.3 主要设备：细胞培养箱、酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），低温高速离心机（德国Eppendorf公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），高速离心机（美国Beckman公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人胃癌MGC80-3、HGC-27与BGC-823细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中。永生化人正常胃上皮GES-1细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养液中。细胞均置于37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养。

1.2.2 CCK-8实验：取对数生长期的细胞，以每孔2×103个细胞接种至96孔板，设6个复孔，每组各接种4块96孔板，常规培养。第2天起，每天同一时间每组各取一块96孔板每孔加入10 μL CCK-8并置于培养箱中继续培养4 h，取出用酶标仪读取吸光值（波长为450 nm），共4 d。以时间为横坐标，酶标仪读取数值为纵坐标绘制各组细胞的生长曲线图。

1.2.3 Transwell迁移与侵袭实验：迁移实验采用8 μm孔径的Transwell小室，而侵袭实验所用小室则需先用基质胶（按1:3稀释）包被于Transwell小室微孔滤膜上，放置37 ℃孵育5 h后才能加入细胞。 取5×105个细胞加入上室，上室培养液为无血清完全培养基，下室为20% FBS完全培养基，每组重复3孔，继续培养12 h（迁移）或24 h（侵袭）后取出小室，棉签擦尽上室面的细胞，95%乙醇固定，0.4%台盼蓝染色。于200倍光镜下随机选取10个视野，计数滤膜下室面的细胞数，取均数作为迁移和侵袭的指数（细胞个数/视野）。

1.2.4 Western blot实验：取质粒转染72 h后或黄芩素处理48 h后的细胞，用预冷的1×PBS洗涤后加入1×Lysis buffer裂解液，冰上静置裂解15 min 后，用细胞刮迅速刮下细胞并转移至1.5 mL离心管中，4 ℃，12 000×g条件下离心15 min，收集上清液；采用BCA法测定蛋白浓度；取40 μg蛋白加热变性，用10%的SDS-PAGE分离胶及5%的浓缩胶对样品进行电泳，电泳完成后，取出凝胶与PVDF膜，加入1×转移缓冲液进行转膜，转完膜后用1×TBST洗涤5 min， 加入封闭液（用TBST配5%脱脂牛奶），室温封闭1 h。弃封闭液，用1×TBST洗3次，加入一抗孵育4 ℃过夜，取出膜用1×TBST室温洗3次，加入二抗孵育1 h， 用1×TBST洗膜3次，加入ECL化学发光液，进行显影，定影。

1.2.5 细胞质粒转染实验：转染实验前1 天，将2×105个/孔胃癌细胞均匀地接种到6 孔板中，约18～24 h后，细胞面积达到70%～90%时开始进行转染。一管加入100 μL Opti-MEM培养基稀释2 μg质粒，一管加入100 μL Opti-MEM培养基稀释4 μL Lipofectamine 2000，室温放置5 min后，将稀释的Lipofectamine 2000加入到稀释好的质粒中，轻弹管壁混匀，室温放置15～20 min，将待转染混合物200 μL，逐滴均匀加入孔中，摇动培养皿使其均匀分布于培养液当中，转染4～6 h后，更换新鲜完全培养液，继续培养。

图1 黄芩素对胃癌细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用

1.2.6 RNA干扰实验：实验前1天消化细胞，并按2×105个/孔胃癌细胞均匀地接种到6孔板中，并用10% FBS无双抗的RPMI 1640培养基继续培养18～24 h。实验前将5 μL 20 μmol/L siRNA稀释于 200 μL Opti-MEM中，轻弹管壁混匀；将5 μL Lipofectamine RNAi MAX稀释于200 μL Opti-MEM中，轻弹管壁混匀；将RNAi MAX/siRNA混合物室温放置15～20 min，然后逐滴加入细胞中，混匀后置于培养箱中培养；转染6 h后，更换新鲜完全培养 液，继续培养并用于后续的黄芩素处理实验。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析；重复测量资料的比较采用重复测量资料方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素抑制胃癌细胞增殖、迁移与侵袭能力 CCK-8实验结果表明，相对于对照组（0 μmol/L）， 10 μmol/L与50 μmol/L的黄芩素在第4天时均能显著抑制胃癌细胞MGC80-3、HGC-27与BGC-823的增殖，且黄芩素50 μmol/L组的抑制作用强于10 μmol/L 组，提示黄芩素抑制胃癌细胞的增殖具有剂量效应作用（P＜0.05），见图1A-C。进一步的体外迁移与侵袭实验结果发现，与对照组相比，10 μmol/L与50 μmol/L的黄芩素均能显著抑制胃癌细胞MGC80-3与HGC-27的迁移与侵袭能力，且黄芩素50 μmol/L 组比10 μmol/L组的抑制作用更显著（P＜0.05），见图1D-E。

2.2 过表达GPR109A抑制胃癌细胞增殖 GPR109A蛋白在胃癌细胞中均为低表达（见图2A）。选取MGC80-3与HGC-27细胞进行GPR109A质粒转染，转染72 h后检测GPR109A蛋白的表达，可见GPR109A蛋白的表达均显著上调（见图2B-C）。通过CCK-8检测GPR109A过表达对MGC80-3与HGC-27细胞增殖的影响，结果发现过表达GPR109A也可显著抑制MGC80-3与HGC-27细胞的增殖（见图2D-E）。

图2 过表达GPR109A抑制胃癌细胞的增殖

2.3 沉默GPR109A表达对黄芩素抑制胃癌细胞增殖的影响 黄芩素可明显上调GPR109A蛋白的表达，且50 μmol/L组比10 μmol/L组的作用更显著（P＜0.05），见图3A-B。进一步，通过RNA干扰GPR109A的表达后观察黄芩素对胃癌细胞增殖的影响，结果发现沉默GPR109A的表达可显著降低黄芩素对胃癌细胞增殖的抑制作用（P＜0.05），见图3C-F。

3 讨论

中药黄芩具有“清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎”的功效，临床主要用于治疗呼吸道感染、急性菌痢和病毒性肝炎等疾病，是中医常用的药物之 一[6-9]。由于黄芩素是黄芩中最重要的生物活性物质之一，近年来有众多研究针对黄芩素进行了体内外的抗肿瘤研究，结果表明黄芩素具有较强的抗肿瘤作用且毒副作用较小，用药安全性高，但其作用的靶点及机制仍不清楚[11-18]。研究发现，黄芩素可显著抑制胃癌细胞AGS、MKN-28、SGC7901和MGC-80-3的增殖、迁移或侵袭[16-18，22-24]。同样，我们的研究也发现黄芩素可以显著抑制胃癌细胞MGC80-3、HGC-27与BGC-823的增殖，以及MGC80-3和HGC-27细胞的迁移与侵袭。但是，黄芩素作用于胃癌的分子靶点目前还不清楚。

有研究发现属于抑制性G蛋白偶联受体（Gi）的烟酸受体（GPR109A）在结直肠癌和乳腺癌中过表达可发挥抗肿瘤的作用[19-21]。目前发现GPR109A受体主要表达于白色脂肪、棕色脂肪、脾和免疫细胞，并对血脂、内环境稳态和脂肪储存具有重要的调节、维持与促进的作用[25-26]。另外，研究也发现GPR109A的表达具有抗炎作用[27]。考虑到慢性炎症对胃癌的发生发展具有的重要作用[28]，我们推测GPR109A的表达可能对胃癌细胞的生长具有抑制作用。为此，本研究通过蛋白检测证明GPR109A 在胃癌细胞中存在较低的表达，而在永生化人正常胃上皮细胞GES-1中则存在较高的表达。我们进一步在胃癌细胞中过表达GPR109A并检测其对胃癌细胞增殖的影响。结果表明，过表达GPR109A能显著抑制胃癌细胞的增殖。我们通过RNA干扰实验发现，沉默GPR109A的表达可部分逆转黄芩素对胃癌细胞的增殖抑制作用，结果表明GPR109A是黄芩素抑癌效应的作用靶点之一，这为进一步阐明黄芩素发挥抑癌作用的功能与分子机制提供了研究思路。

图3 黄芩素上调GPR109A的表达抑制胃癌细胞的增殖作用