丙酸钠通过抑制NLRP3保护脓毒症大鼠的结肠组织

2020-10-10谢献政杨然栋陈肖鸣

温州医科大学学报 2020年9期

谢献政，杨然栋，陈肖鸣

（1.温州医科大学附属第一医院小儿外科，浙江温州 325015；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院小儿外科，浙江温州 325027）

脓毒症是重症监护室患者常见的死亡原因[1]。肠道是脓毒症诸多受损器官中受累最早的器官，同时肠道受损又能促进脓毒症全身炎症反应[2-3]。脓毒症时，肠道组织中炎性因子分泌和释放增加，肠黏膜屏障受到破坏，有害物质更易进入机体并随血液循坏播散至全身各处[4]。NLRP3炎性小体是目前研究最多的一种炎性小体。NLRP3炎性小体被激活后，能调节caspase-1的活化，产生和分泌成熟的IL-1β和IL-18，参与炎症反应。研究表明，NLRP3炎性小体可能参与脓毒症的发生进展，影响疾病的严重程度和预后[5]。

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）是细菌在肠道中发酵膳食纤维产生的主要代谢产物，主要包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等。SCFA在维持肠道稳态以及肠道上皮细胞的形态和功能方面具有重要作用[6-7]。近年来，有报道表明丙酸盐在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）引起的结肠炎模型中，可以通过减少炎症和氧化应激来改善肠屏障功能[8]。但目前仍未见丙酸盐在脓毒症这一方面的研究。在本研究中，我们将探究丙酸钠（sodium propionate，SP）对脓毒症的结肠损伤是否具有保护作用，并研究其对NLRP3炎性小体的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体质量180～200 g，6～8周龄，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 主要试剂：ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；SP购自美国Sigma公司；claudin-1、occludin、NLRP3、caspase-1、IL-β、IL-18 一抗购自美国Affinity公司；beclin-1、LC3 II一抗购自美国CST公司，HE染色试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症动物模型的建立：采用盲肠结扎穿刺法（cecum ligation and puncture，CLP）建立脓毒症模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型组、假手术+SP组和模型+SP组（Sham、CLP、Sham+SP和CLP+SP），每组20只。CLP组、CLP+SP组大鼠用戊巴比妥钠麻醉并固定，腹部消毒，并予正中切口，分离暴露盲肠，将盲肠远端结扎并用针头对穿2次，将盲肠收纳回腹，逐层关腹。Sham组、Sham+SP组大鼠仅打开腹腔，暴露盲肠，不予结扎穿孔，逐层关腹。处理后0.5 h和4 h后给予Sham+SP和CLP+SP组大鼠腹腔注射200 mg/kg SP。Sham组和CLP组注射等量 0.9%氯化钠溶液。处理24 h后，处死各组10只大鼠，收集结肠组织，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 生存率的检测：每隔12 h观察各组剩余10只大鼠的存活情况，记录大鼠3 d的存活率。

1.2.3 观察指标：HE染色观察各组大鼠结肠结构变化；ELISA检测结肠组织中IL-6、TGF-β和TNF-α含量；Western blot和免疫组化染色检测结肠紧密连接蛋白（claudin-1和occludin）和NLRP3炎性小体的表达情况。

1.3 统计学处理方法利用GraphPad Prism 6软件进行统计分析并绘制生存曲线；多组间比较用单因素方差分析；计数资料比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP对脓毒症大鼠生存率的影响 SP对CLP组大鼠72 h生存率的影响见图1。Sham组和Sham+SP组动物72 h内均无死亡。CLP组大鼠72 h生存率为10%，CLP+SP组大鼠72 h的存活率为50%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 SP减轻脓毒症大鼠结肠组织病理损伤 Sham组和Sham+SP组中结肠组织大体观无明显变化，表面光滑，无水肿充血，镜下观黏膜上皮完整连续，腺体排列规则，结构清楚，无炎性细胞浸润。CLP组大体观充血水肿，镜下观黏膜上皮间断缺失，腺体排列紊乱，腺体间有炎性细胞浸润等现象。与CLP组相比，CLP+SP组的黏膜上皮缺失、腺体排列紊乱和炎性细胞浸润较少。见图2。

2.3 SP减少脓毒症大鼠结肠组织的炎症因子 CLP处理后大鼠的结肠组织中，三种炎症细胞因子的浓度增加（P＜0.05）。而SP明显抑制了CLP诱导的炎症细胞因子浓度的升高（P＜0.05）。见图3。

图1 各组大鼠生存率比较（n=10）

图2 各组大鼠结肠组织HE染色

图3 各组大鼠TNF-α、IL-6和TGF-β含量变化

2.4 SP增加脓毒症大鼠结肠紧密连接蛋白表达 Western blot结果显示（见图4），Sham组和Sham+ SP组的紧密连接蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。CLP组的claudin-1和occludin蛋白表达与Sham组比降低（P＜0.05）。与CLP组相比，CLP+SP组claudin-1和occludin的蛋白表达有所增加（P＜ 0.05）。此外，各组结肠组织中claudin-1和occludin的免疫组化染色结果（见图5）与上述Western blot结果一致（P＜0.05）。

2.5 SP抑制脓毒症大鼠结肠NLRP3炎性小体激活 Sham组和Sham+SP组NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。CLP组NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表达显著高于Sham组（P＜0.05）。而与CLP组相比，CLP+SP组这些蛋白的表达显著降低（P＜0.05）。此外，各组的NLRP3和caspase-1免疫组化染色结果与上述Western blot结果一致，CLP+SP组的表达较CLP组有所降低（P＜0.05）。见图6-7。

图4 各组大鼠结肠组织occludin、claudin-1蛋白表达情况

3 讨论

丙酸盐是肠道菌群在宿主肠道内的主要代谢产物之一。据报道，丙酸盐可减少LPS刺激的中性粒细胞TNF-α的释放，抑制NF-κB的基因表达，具有抗炎作用[9]。前期研究发现在大鼠哺乳期丙酸盐可通过增加紧密连接蛋白的表达来促进结肠的屏障功能[10]。而在脓毒症相关性肠损伤尤其是结肠损伤方面，有关丙酸盐的研究尚未见报道。正常情况下，完整的肠屏障能保护机体免受损伤，然而当肠屏障损伤，细菌移位或有害物质进入体内，使得机体脓毒症恶化[11]。因此，研究丙酸盐在脓毒症结肠损伤中的作用及其潜在作用机制有助于深入阐明两者间的关系，为脓毒症期结肠损伤的预防和治疗提供新的途径。

在本研究中，CLP诱导的脓毒症大鼠模型死亡率很高，在前期的实验中，我们发现，腹腔注射 200 mg/kg SP处理可显著降低大鼠死亡率（P＜0.05），提示SP可保护大鼠免受CLP诱导的死亡。进一步的实验中，根据HE染色结果提示，SP对结肠的组织结构具有保护作用，能减少中性粒细胞的浸润，保护黏膜完整性，调节炎症反应的细胞因子（包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子）。促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间不断相互作用，引起细胞因子风暴[12]。早期抗炎细胞因子IL-6和TNF-α由巨噬细胞分泌并刺激免疫系统，已经有研究证明其在脓毒症模型中显著升高[13]。TGF-β是抗炎细胞因子的一种，研究发现，抑制TGF-β有助于保护脓毒症大鼠模型[14-15]。我们的实验结果显示，SP能显著降低脓毒症大鼠结肠组织中的IL-6、TNF-α和TGF-β水平。与之前的报道一致，即丙酸盐可以显著减少DSS诱导的结肠炎模型中的炎症细胞因子[8]。因此，我们推测，SP通过抑制IL-6、TNF-α和TGF-β等炎症细胞因子，阻止细胞因子风暴，改善脓毒症结肠组织的炎症反应。

肠上皮细胞之间的紧密连接是肠黏膜屏障中不可或缺的一部分，在维持肠屏障结构和功能方面起着重要作用。有研究表明，由于肠屏障受损，水电解质吸收失衡，claudin-1基因敲除鼠不能存活24 h[16]。肠屏障损伤被认为是脓毒症多器官功能障碍综合征的病因之一[17]。肠道病原体常常通过改变紧密连接破坏肠屏障。本研究结果显示，CLP+SP组的claudin-1和occludin的蛋白表达比CLP组显著增加，2组差异具有统计学意义（P＜0.05）。从免疫组化染色结果来看，CLP+SP组结肠组织比起CLP组，呈棕色的紧密连接蛋白颜色更深，且分布更为连续密集。这表明SP通过增加紧密连接蛋白的表达对脓毒症大鼠结肠屏障起保护作用。

图5 各组大鼠结肠组织occludin、claudin-1蛋白表达情况（免疫组化法）

图6 各组大鼠结肠组织NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达情况

脓毒症早期，适度的炎症反应可以抵挡外来病原体从而避免机体组织进一步的损伤。然而，过度的炎症反应会导致机体的脏器损伤和功能障碍。NLRP3炎性小体被认为可能会参与脓毒症的炎症级联放大，对于脓毒症患者的病情严重程度的预测，具有一定价值[18-19]。有研究认为NLRP3炎性小体在维持肠道内环境稳定中发挥重要作用[20]。NLRP3被激活后，参与肠道的炎症反应，分泌IL-18和IL-1β，募集炎性细胞浸润，减弱肠道黏膜屏障功能。本实验结果显示，SP可以减少NLRP3炎性小体活化相关蛋白表达，表明SP可能通过抑制NLRP3炎性小体减少脓毒症结肠损伤。由于可用于动物实验的NLRP3激动剂的不足，在接下来的实验中，若能在分组上再添上CLP+SP+NLRP3激动剂组，则能更进一步证明SP抑制NLRP3炎性小体。