右美托咪定对糖尿病小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用①

杜 刚 陈 娜 刘晓艳 赵 亮 (山东省淄博市第一医院手术麻醉科,淄博 255200)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种代谢紊乱性疾病，伴有多种并发症，包括微血管和大血管病变及缺血再灌注性(ischemia/reperfusion，IR)损伤等[1]。IR是造成急性肾损伤的高危因素，可造成肾组织细胞损害，如肾小管内皮细胞凋亡和坏死[2，3]。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是具有多种生物学功能的细胞器，包括对细胞各种压力的响应，如低氧、饥饿、感染和分泌需要的变化[4]。ER应激是对IR损伤的应激反应，IR损伤会产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并造成蛋白质折叠和组装紊乱，这些未折叠或错误折叠的蛋白质积聚后会造成ER应激[5]。右美托咪定(dexmedetomi-dine，DEX)是一种具有高度特异性和α2肾上腺素能的高效抑制剂，具有镇静、止痛和交感神经阻滞的效用[6]。在肾组织中，α2肾上腺素能受体广泛分布于肾小管的近端、远端及其他脉管周围[7]。研究显示，DEX可以在IR性肾损伤中有效减少肾小管上皮细胞凋亡，并促进肾小管结构重建[6-8]。有动物实验表明，DEX可以有效保护IR损伤后的多种器官损伤，包括肾脏、心脏、大脑等，其主要通过抗凋亡、抗炎和抗氧化应激等发挥保护功能[9-11]。本文根据既往研究成果，探究DEX在糖尿病小鼠肾IR损伤中的治疗效果及ER应激和细胞凋亡相关机制，以期为糖尿病肾病的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 血清尿氮素含量测定试剂盒(货号：BC1535)购自北京索莱宝科技有限公司；血清肌酐酸测定试剂盒(货号：GMS70021.1)购自上海杰美基因医药科技有限公司；尿蛋白含量检测试剂盒(货号：GB370S)购自北京九强生物技术股份有限公司；小鼠LDL检测试剂盒(货号：QY-M30023)、小鼠SOD检测试剂盒(货号：QYS-03061)和小鼠MDA检测试剂盒(货号：QYS-03052)购自上海齐一生物科技有限公司；Click-iT®Plus TUNEL assay试剂盒(货号：C10618)购自Invitrogen公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(货号：C0105)购自碧云天；CHOP(货号：ab11419)、ATF6(货号：ab37149)、Cleaved Caspase-12(货号：ab62484)、GAPDH(货号：1056)一抗购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.1.2仪器 半干转膜仪、电泳仪均购于美国伯乐公司；Multiskan GO酶标仪购自Thermo；Gel View 6000化学发光凝胶成像仪购于广州云星仪器有限公司；分析天平ME204购自梅特勒托利多国际贸易(上海)有限公司；DW-86L578J -86℃超低温冰箱、DW-25L262h 25℃低温保存箱和HYC-3102～8℃医用冷藏箱购自海尔公司；Eppendorf 5702R台式冷冻离心机购自德国艾本德股份公司。

1.1.3实验动物 50只8周龄糖尿病db/db小鼠购自北京维通利华实验动物公司，许可证号为SYXK (京) 2014-0001，合格证号：0015675。

1.2方法

1.2.1糖尿病小鼠肾IR模型建立 50只糖尿病db/db小鼠适应性饲养一周后随机平均分为假手术组(Sham组)、IR手术组(IR组)及IR手术+DEX组(DEX剂量分别为12.5、25、50 μg/kg)。IR+DEX组小鼠在手术前30 min分别腹腔注射12.5、25、50 μg/kg 的DEX。IR组小鼠经非创伤性血管钳封闭双肾蒂，缺血45 min后解除封闭。Sham组小鼠经相同解剖过程，但不进行肾蒂封闭。手术结束后，青霉素溶液(20万 U/ml)冲洗手术切口，缝合皮肤，并肌注青霉素钠4万U/只以防术后感染。

1.2.2小鼠基本指标检测 各组处理结束后，提取小鼠血清及肾组织标本，检测血清中血清尿氮素(blood urea nitrogen，BUN)、尿蛋白和血清肌酐酸表达；组织经处理后检测相应LDH、SOD和MDA表达水平(详见下述)。

1.2.3HE染色检测糖尿病小鼠肾组织形态 切片经3次二甲苯浓度脱蜡，梯度浓度酒精脱苯后，蒸馏水冲洗5 min×2次；苏木素染核15 min，蒸馏水冲洗；0.5%盐酸酒精分色，蒸馏水冲洗15 min；70%和80%酒精先后浸泡10 min，伊红复染1 min，90%酒精分化10 s；95%酒精脱水2次，各10 min，100%酒精脱水2次，各15 min，二甲苯透明3次，每次时间分别为10 min、15 min、15 min；中性树脂封片观察。

1.2.4TUNEL染色鉴定糖尿病小鼠肾组织细胞凋亡 小鼠处死后肾组织经石蜡包埋，二甲苯中脱蜡5～10 min，换用新鲜二甲苯，再次脱蜡5～10 min；经无水乙醇5 min，经90%乙醇2 min，70%乙醇2 min脱苯，蒸馏水2 min。滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，P0106洗涤液20～37℃下作用15～30 min。PBS洗涤3次。配制适当量TUNEL检测液滴加至样品，37℃避光孵育60 min。洗涤后用抗荧光猝灭封片液封片后显微镜下(激发波长范围为450～500 nm)观察。

1.2.5ELISA检测肾组织细胞炎症因子 ELISA法检测糖尿病小鼠肾组织中相关ER应激分子乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等水平。小鼠肾组织从-86℃超低温冰箱中取出后，冰上溶解，称取0.03 g组织，剪碎研磨，加入1 ml PBS缓冲液，4 000 r/min(离心半径=13.5 cm)低温离心8 min，取上清液用于实验。分别设空白孔，标准品孔，待测样品孔，标准品孔加入标准品50 μl，样品孔先加入样品稀释液40 μl后加待测样品10 μl。封板后37℃孵育30 min。洗涤母液经蒸馏水稀释30后备用。缓慢揭掉封板膜，弃去液体后，每孔加洗涤液清洗30 s，重复5次，拍干酶标板。每孔加酶标试剂50 μl，空白孔不加。再次封板后37℃孵育30 min。重复上述洗涤步骤，各孔加入显色剂A液和B液各50 μl，缓慢振荡混匀后，37℃避光显色10 min。各孔加入50 μl 终止液终止反应(终止后蓝色立即转为黄色)。检测450 nm波长下OD值(测定应在加入终止液后的15 min内进行)。

1.2.6Western blot检测细胞中蛋白表达 检测组织中ER应激及凋亡相关因子CHOP、ATF6和Cleaved Caspase-12表达水平。收集细胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。BCA试剂盒检测总蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h后加入一抗，4℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL曝光显影，显色并统计灰度值计算相对表达量。

2 结果

2.1DEX改善糖尿病小鼠肾功能异常指标 与Sham组小鼠相比，IR组小鼠BUN、尿蛋白和血清肌酐酸均显著上调(P<0.01)。经DEX治疗后，与IR组小鼠相比IR+DEX各剂量组小鼠BUN、尿蛋白和血清肌苷酸均下降(P<0.05或P<0.01)(图1)。

图1 各组糖尿病小鼠肾功能指标检测

2.2DEX改善糖尿病小鼠体内ER应激相关分子水平 ELISA结果显示，与Sham组相比，IR组ER应激产物LDH和MDA表达升高(P<0.01，图2A、C)；SOD表达降低(P<0.01，图2B)；与IR组相比，IR+DEX各剂量组ER应激产物LDH和MDA表达降低(P<0.05或P<0.01，图2A、C)，而SOD表达升高(P<0.05或P<0.01，图2B)。

图2 ELISA检测糖尿病小鼠肾组织ER应激相关分子水平

2.3DEX改善糖尿病小鼠肾组织细胞形态 HE染色结果显示，与Sham组相比，IR组糖尿病小鼠肾组织细胞结构不清晰，肾小管扩张，细胞变扁，细胞核浓缩，肾小管中有脱落细胞，同时伴有炎症细胞浸润及充血现象；经DEX治疗后，与IR组相比，IR+DEX各剂量组小鼠肾组织细胞轮廓逐渐清晰，肾小管紧实，细胞核恢复正常，炎症浸润和充血现象得到改善(图3)。

图3 HE染色检测糖尿病小鼠肾组织细胞形态

2.4DEX改善糖尿病小鼠肾组织细胞凋亡程度 TUNEL染色结果表明，与Sham组相比，IR组小鼠肾小管细胞发生明显凋亡(P<0.01)；经DEX处理后的各IR+DEX剂量组小鼠肾小管细胞凋亡现象均得到改善(P<0.05或P<0.01，图4)。

图4 TUNEL染色鉴定糖尿病小鼠肾组织细胞凋亡

2.5DEX改善糖尿病小鼠肾组织ER应激及凋亡相关因子水平 Western blot结果显示,与Sham组相比，IR组三者表达均上调(P<0.01)；与IR组相比，各IR+DEX剂量组CHOP和Cleaved Caspase-12表达下调(P<0.05或P<0.01)，IR+DEX低剂量组ATF6表达差异无统计学意义，IR+DEX中、高剂量组ATF6表达水平降低(P<0.05或P<0.01,图5)。

图5 Western blot检测各组ER应激和凋亡相关蛋白表达

3 讨论

糖尿病是常见的疾病类型，全球大约有2.85亿患者正在遭受糖尿病折磨，且这一数据将在2030年增至4.3亿人[12]。糖尿病患者同时会伴有多种并发症，包括微血管和大血管病变及IR损伤等，导致肾损伤和肾功能紊乱[1]。因此针对肾IR损伤相关机制的研究具有重要意义。

肾IR损伤相关的ER应激和细胞凋亡机制尚未阐明。ER功能失调和应激反应不但是Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的主要发病机制，也是其他自体免疫性疾病和神经退化性疾病的基础[13]。大量研究表明，在糖尿病进程中，ER系统内平衡性改变可直接导致胰岛β细胞功能紊乱甚至细胞死亡[14]。本研究建立db/db小鼠糖尿病模型，以双侧肾IR模型为研究体系，发现IR模型组小鼠肾组织细胞发生严重的ER应激反应，肾组织细胞内LDH和MDA表达上调，SOD表达下调。

深入研究糖尿病肾IR损伤发病机制对控制糖尿病急性肾损伤具有重要意义。目前有几种常用方法来治疗IR，药物护理是降低IR损伤风险最常用的手段，如DEX、硫酸镁及胰岛素等[15-17]。本研究探究了DEX对糖尿病小鼠肾IR损伤的保护作用，根据HE染色和免疫组化结果确定DEX可避免由IR导致的肾组织细胞的损伤和凋亡；并且检测到BUN、尿蛋白和血清肌酐酸明显下调。

肾IR损伤是在缺血环境和再次灌注过程中产生的复杂炎症反应过程，伴随一系列细胞炎症活动事件，如炎症细胞浸润增加微血管通透性、组织水肿、肾髓质细胞功能紊乱及肾间质及肾小管形变等症状[18-20]。既往研究表明，DEX预处理对肾脏IR损伤具有保护作用，且是以α2肾上腺素受体依赖性方式发挥作用，并通过PI3K/AKT信号通路活化来发挥抗凋亡活性[21]。本研究表明DEX治疗可改善小鼠受损的肾组织。在抗ER应激方面，IL-4、IL-10等可上调SOD，下调MDA和LDH表达[22，23]，本研究结果证实DEX处理后小鼠肾组织中SOD显著上调，LDH和MDA显著下调，ER应激水平降低。Western blot检测DEX处理后小鼠肾组织ER应激相关蛋白表达水平，发现CHOP和ATF6表达降低，说明DEX可以有效降低小鼠ER应激反应。

肾IR损伤不仅伴有严重的ER应激反应，同时还会造成肾小管内皮细胞凋亡和急性肾小管细胞坏死等[18-20]。本研究利用TUNEL染色检测各处理组肾组织细胞后发现，IR组小鼠细胞严重凋亡；经DEX治疗后，细胞凋亡现象得到明显缓解。进一步考察凋亡相关蛋白表达情况后发现，Cleaved Caspase-12在IR组中显著上调，在接受DEX治疗后则恢复至接近Sham组小鼠水平。Su等[24]报道称，内质网应激凋亡途径是重要的内源性凋亡途径之一，Caspase-12是定位于内质网外膜上的促凋亡分子，是该途径的重要凋亡蛋白。表明在糖尿病小鼠IR损伤中，DEX可有效抑制细胞凋亡。

综上所述，DEX对糖尿病小鼠肾IR损伤具有一定治疗效果，其发挥作用的机制可能通过DEX抑制肾组织细胞中ER应激和凋亡相关通路实现。但ER应激反应涉及诸多通路，如Ire1通路、Perk通路及ATF6通路等[5]；IR损伤的机制具体涉及哪几种通路还需要进一步明确。