淫羊藿苷抑制PI3K/AKT通路对肺腺癌A549细胞存活和转移的影响①

文艳梅 梁宗安 徐治波 苟冶然 邓正旭 (成都市第二人民医院呼吸内科，成都 610017)

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，死亡率极高，发病率居男性肿瘤第1位,居女性肿瘤第2位，5年生存率较低，给患者和社会造成严重负担[1-3]。尽管初始治疗效果良好，但小细胞肺癌通常在1年内复发，并对多种药物耐药[4]。因此，需要寻找新的策略改善晚期不可切除、转移性肺癌患者的生存率和生活质量。PI3K/AKT通路是调控细胞生长的关键信号通路，该通路的激活能促进细胞生长，增强细胞侵袭和转移能力[5]。近年来，天然提取物备受关注，广泛用于癌症治疗的辅助治疗。淫羊藿是广泛分布于我国西南和中部地区的植物，亦分布于亚洲、中东和欧洲等温带和亚热带地区，其主要活性成分为淫羊藿苷，在抗肿瘤中的潜在作用已被逐渐熟知，如对食管癌、肝癌、乳腺癌、成神经管细胞癌等多种癌症均具有抵抗作用[6-8]。因此，本文以肺腺癌A549细胞为研究对象，探讨淫羊藿苷对体外培养的A549细胞存活和转移特性的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系与试剂 人肺腺癌细胞株A549购自北京中科院肿瘤细胞库；淫羊藿苷(纯度≥98%)购自上海纯优生物科技有限公司；CCK8试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司；单抗、辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Santa Cruze公司；RIPA裂解液购自美国Sigma公司；Transwell小室购自北京优尼康生物技术有限公司；Matrix基质胶购自BD公司。

1.1.2仪器 CO2培养箱购自美国ThermoForma公司；PCR仪、电泳仪及半干转膜仪购自美国伯乐公司；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司；超净工作台购自苏州中亚净化设备有限公司；普通光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 用含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基悬浮肺腺癌A549细胞，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。镜下观察细胞生长状态，当细胞融合率达到80%以上时进行消化传代。

1.2.2CCK8实验 将上述A549细胞悬液接种于96孔板，细胞贴壁后，随机分为0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300和400 μmol/L组，每组设5个复孔。培养24 h后，10 μl/孔加入CCK8溶液，继续孵育4 h，450 nm处检测A549细胞存活率。根据细胞存活率结果，选择无明显细胞毒性的最大浓度进行后续实验。

1.2.3划痕实验 12孔板背面用记号笔划5条平行直线，高温灭菌后备用。A549细胞以1×105个/ml接种于12孔板。细胞贴壁后，用10 μl枪头垂直于培养板背面的横线划痕，PBS清洗3次，根据细胞存活率实验结果，将细胞随机分为4组：Ctrl组、Icariin (10 μmol/L)组、Icariin (20 μmol/L)和Icariin(50 μmol/L)组，给予对应浓度药液处理后，继续培养24 h。随机选取5个视野，检测细胞迁移情况。

1.2.4Transwell实验 提前用Matrigel基质胶包被Transwell小室上层，将A549细胞传代接种于小室上层，用不含胎牛血清的培养液培养，下层加入正常细胞培养液。培养24 h后，无菌拭去Matrigel基质胶和小室上层细胞，洗涤后用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色20 min，流水冲洗并晾干。显微镜下每组随机选取5个视野对染色细胞进行统计。至少重复3次，每组6个复孔。

1.2.5Western blot实验 将细胞传代接种于6孔板，1 ml/孔，培养24 h后，分组同1.2.3，加入不同浓度淫羊藿苷，继续培养24 h后收集各组细胞。用添加蛋白抑制剂的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解，提取总蛋白，4℃离心收集，取上清，BCA试剂盒定量。每组取等量蛋白质用12% SDS-PAGE分离蛋白后，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。弃去一抗，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光显影。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1淫羊藿苷对A549细胞存活率的影响 与Ctrl组相比，100 μmol/L及以上浓度淫羊藿苷处理细胞，存活率显著降低(P<0.05，图1)，且呈剂量依赖性，100 μmol/L及以下浓度组细胞存活率与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。表明淫羊藿苷能降低人肺腺癌细胞A549存活率，当终浓度达到100 μmol/L时出现明显细胞毒性作用。因此采用无细胞毒性的3个最大浓度进行后续实验，即10、20和50 μmol/L。

图1 淫羊藿对A549细胞存活率的影响

2.2淫羊藿苷对A549细胞凋亡的影响 与Ctrl组相比，淫羊藿苷各剂量组细胞凋亡率均呈上升趋势(P<0.05，图2)，且呈剂量依赖性。

图2 淫羊藿对A549细胞凋亡的影响

2.3淫羊藿苷对A549细胞侵袭迁移能力的影响 与Ctrl组相比，淫羊藿苷各剂量组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，且呈剂量依赖性。划痕愈合率明显下降(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图3。提示淫羊藿苷可剂量依赖性地降低A549细胞侵袭迁移能力。

图3 淫羊藿对A549细胞侵袭迁移能力的影响

2.4淫羊藿苷对A549细胞EMT的影响 与Ctrl组相比，10、20和50 μmol/L Icariin组E-cadherin (上皮标记蛋白)表达随淫羊藿苷浓度增大而逐渐提高(P<0.05)，而间质标记蛋白(N-cadherin)和Vimentin(波形蛋白)表达呈剂量依赖性下调(P<0.05，图4)。提示淫羊藿苷可剂量依赖性地抑制体外培养A549细胞转移。

图4 淫羊藿对A549细胞EMT的影响

2.5淫羊藿苷对A549细胞PI3K、AKT磷酸化的影响 与Ctrl组相比，Icariin 10 、20和50 μmol/L组PI3K、AKT磷酸化水平均明显降低(P<0.05，图5)，且呈剂量依赖性。

图5 淫羊藿对A549细胞PI3K、AKT磷酸化的影响

2.6淫羊藿、740Y-P单独/联合使用对A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响 与Ctrl组相比，两者单用时可分别提高或降低A549细胞凋亡率(P<0.05，图6A)，联合使用时，细胞凋亡率比740Y-P单独使用时明显上调(P<0.05,图6A)，50 μmol/L淫羊藿苷或740Y-P可显著降低或提高细胞增殖水平、侵袭细胞数和划痕愈合率(P<0.05，图6B～D)，以上指标在两者联用时比单用740Y-P时明显下调(P<0.05)；50 μmol/L淫羊藿苷能明显下调PI3K/AKT磷酸化水平，而740Y-P则能上调PI3K/AKT磷酸化水平，两者联用能明显抑制740Y-P单用时对PI3K/AKT磷酸化的上调作用(P<0.05，图6E～G)。提示淫羊藿苷可有效逆转PI3K激活剂740Y-P对A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。

图6 淫羊藿苷与740-YP单独/联合使用对A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响

3 讨论

肺癌的发生是异常复杂的过程，涉及多种分子、细胞因子、基因等，其中信号通路是近年研究热点之一。淫羊藿具有广泛的生物活性，可单独或联合用于骨质疏松症治疗、性功能障碍、高血压和炎症性疾病(如慢性阻塞性肺疾病)[9-13]。淫羊藿是抗肿瘤的潜在药物，能通过抑制多种信号通路调节机体炎症微环境，从而表现出多种癌细胞毒性，如在小鼠肝癌和白血病肿瘤模型中对体内和体外的癌细胞系均具有抑制作用[14]。因此，淫羊藿单独或与化疗药物联合使用可能是癌症的有效干预方法，可加强治疗效果和避免耐药性[7]。

抑制肿瘤细胞增殖速度是抗癌药发挥作用的重要方向。研究表明，植物提取物淫羊藿苷作用于体外培养的人卵巢癌细胞SKOV3和多药耐药细胞SKVCR细胞时，可剂量依赖性抑制其增殖能力[15]。髓母细胞瘤是儿童最常见的脑恶性肿瘤，Sun等[16]研究表明，淫羊藿苷通过诱导细胞S期阻滞抑制髓母细胞瘤细胞增殖。作为淫羊藿另一活性成分淫羊藿苷Ⅱ也能通过ROS/p38/p53途径抑制人黑色素瘤A375细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，且呈浓度和时间依赖性地降低肝癌HepG2细胞存活率，抑制肝癌移植瘤小鼠肿瘤细胞生长[17,18]。本研究也表明，100 μmol/L淫羊藿苷对A549细胞具有明显的细胞毒性，在10、20和50 μmol/L浓度范围内，可显著降低体外培养的A549细胞存活率，影响A549细胞增殖能力。

促进肿瘤细胞凋亡也是抗癌药物发挥抗癌作用的机制之一。研究表明，淫羊藿苷能通过诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡，抑制急性早幼粒细胞白血病、卵巢癌、B16黑色素瘤进程，与本研究结果即淫羊藿苷能显著提高A549细胞凋亡水平相似[19-21]。

药物发挥抗癌作用时可抑制肿瘤细胞侵袭迁移。研究表明，淫羊藿苷能影响食管癌EC109和TE1、胃腺癌BGC-823细胞黏附和转移。淫羊藿苷Ⅱ可上调N-cadherin、vimentin表达和下调E-cadherin表达，从而抑制肺癌A549和H1299细胞迁移和EMT[24]。本研究结果证明，10、20和50 μmol/L淫羊藿苷均能降低体外培养的A549细胞的侵袭迁移能力，且呈剂量依赖性，其机制与上调E-cadherin、下调N-cadherin和Vimentin表达相关。

PI3K隶属于磷脂激酶家族，机体内多种因子均能激活PI3K，调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种信号传导[25]。研究表明，该通路的异常激活与多种功能性疾病的发生发展相关，如慢性阻塞性肺疾病、卵巢癌、宫颈癌和肝癌等[26-29]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)高表达激活PI3K/AKT通路而上调炎症因子表达，从而可加重慢性阻塞性肺疾病的病理学改变情况。为证明淫羊藿苷抑制体外培养的人肺腺癌A549细胞的存活和转移特性与PI3K/AKT信号通路的相关，本研究检测了通路蛋白的磷酸化水平，并考察了PI3K激活剂740-YP对A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响，结果表明，淫羊藿苷能显著下调PI3K/AKT通路蛋白的磷酸化水平，有效逆转740-YP对A549细胞的作用。

本研究探讨了淫羊藿苷在体外实验中对A549肿瘤细胞存活和转移的影响及机制，证明淫羊藿苷可通过抑制PI3K/AKT信号通路降低肺腺癌A549细胞的存活率和转移特性。