吉马酮激活AMPK诱导宫颈癌Hela细胞自噬和凋亡①

姚宗花 张先娟 郭敬敬 刘美艳 张丽丽 (滨州医学院附属医院妇产科，滨州 256603)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，位居世界女性恶性肿瘤第三，全球每年发病人数约为50万，死亡率高达50%，主要发生于亚洲[1]。目前宫颈癌治疗仍以手术、放疗、化疗等为主，但不良反应发生率较高，严重影响患者身心健康[2，3]。因此，急需继续寻找宫颈癌的有效治疗策略。姜黄属植物是广泛应用于亚洲国家的抗肿瘤药物，其主要成分为吉马酮(gemmarone，GMC)，具有抗肿瘤、抑制脂肪形成、抗炎和免疫调节作用[4,5]。GMC是单环倍半萜类化合物,具有倍半萜类化合物共有的特性，近年关于GMC的药理作用研究越来越广泛[6-8]。GMC具有抗肿瘤作用，可抑制肝癌、肺癌等癌症细胞增殖并诱导细胞凋亡，且可直接杀伤肿瘤细胞，但其对宫颈癌的作用鲜有报道。由于宫颈癌细胞增殖、自噬能力不足和凋亡机制失调，导致宫颈癌患者预后较差[9，10]。因此，寻找抑制增殖、促进凋亡和自噬的有效靶向抗癌剂对宫颈癌患者具有重要意义。本文旨在研究GMC对宫颈癌Hela细胞自噬和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验药物和试剂 GMC购自美国Sigma-Aldrich (42924)；Dulbecco′s modified Eagle′s medium培养基(12002-090)、胰蛋白酶(27254-019)胰蛋白酶(25200-056)和青-链霉素(15140-122)购自GIBCO BRL公司；AMPK抑制剂AICAR (A8184)购自美国APExBIO生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司(KH668)；AnnexinV/PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司(KGI106)；Anti-Ki67(ab15580)和Anti-Caspase-3(ab13585)均购自Abcam公司；BCA试剂盒购自碧云天生物技术研究所(P001S)；抗Beclin 1(sc54782)、 P62(sc58241)、 LC3Ⅰ/Ⅱ(sc47821)购自Santacruz公司；免疫荧光试剂盒购自上海优予生物科技有限公司(KGIF002)。

1.1.2细胞来源 ECT1/E6E7人宫颈永生化鳞状细胞与人宫颈癌Hela细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取对数长生长期Hela细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L链霉素)，5% CO2、37℃培养。培养基每2 d更换1次，平均3～4 d传代1次。

1.2.2细胞处理与分组 人宫颈永生化鳞状细胞ECT1/E6E7和宫颈癌Hela细胞用不同浓度的GMC(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)处理48 h。CCK-8试剂盒检测细胞存活率，根据存活能力选择无细胞毒性的宫颈癌Hela细胞进行后续实验。宫颈癌Hela细胞分为4组：对照组(0 μmol/L)、GMC低浓度组(5 μmol/L)、GMC中浓度组(10 μmol/L)、GMC高浓度组(20 μmol/L)。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖 参考文献[7]，各组细胞处理后，连续培养宫颈癌Hela细胞4 d，每 d检测各组细胞数量，绘制增殖倍数曲线。用培养基将CCK-8溶液稀释至10%，制成1×106个/ml的细胞悬液，37℃培养1～4 h，450 nm处检测吸光度，计算细胞增殖倍数。

1.2.4细胞凋亡检测 参考文献[11]，收集悬浮细胞至10 ml离心管，3×106ml/孔，500～1 000 r/min离心5 min，弃培养液，孵育缓冲液洗涤1次，500～1 000 r/min 离心5 min，用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min，500～1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞孵育缓冲液洗1次，加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃孵育20 min，避光振动，流式细胞仪分析，激发光波长488 nm，用波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，波长大于560 nm的滤器检测PI。

1.2.5Western blot 参考文献[12]，收集各组细胞冰上溶解25 min。12 000 r/min离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白含量。提取等量蛋白样品(20 mg)，100℃变性5 min。SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，4℃加入相应一抗孵育过夜，清洗，4℃加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，加入发光液曝光处理，ImageJ软件统计灰度值。

1.2.6免疫荧光检测LC3含量 爬片置于12孔板，以2×104个/孔将细胞接种于爬片。Control、GMC-L、GMC-M、GMC-H组干预宫颈癌Hela细胞4 h，免疫荧光法检测LC3蛋白免疫荧光。

2 结果

2.1人宫颈正常细胞ECT1/E6E7和宫颈癌Hela细胞生存能力比较 人宫颈正常细胞ECT1/E6E7在各浓度GMC处理下细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)，宫颈癌Hela细胞随GMC浓度升高，存活率降低(P<0.01)。见图1。

2.2GMC抑制宫颈癌Hela细胞增殖 与对照组相比，GMC-L组、GMC-M组、GMC-H组细胞增殖倍数依次降低，GMC浓度越高，细胞增殖倍数越低(P<0.01)，见图2；处理时间越长，增殖能力越低。说明GMC以剂量依赖和时间依赖的方式抑制宫颈癌Hela细胞增殖。

图2 GMC对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

2.3GMC促进宫颈癌Hela细胞凋亡 与对照组相比，GMC各细胞处理组凋亡率依次升高(P<0.01)；细胞增殖标记Ki67表达随GMC浓度升高而降低，Caspase-3表达随GMC浓度升高而升高。说明GMC以浓度依赖方式促进宫颈癌Hela细胞凋亡，见图3。

图3 GMC对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

2.4GMC促进宫颈癌Hela细胞自噬 GMC可显著下调P62蛋白水平，上调Beclin 1和LC3Ⅱ蛋白水平(P<0.01)，且呈剂量依赖性。GMC可促进自噬。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，说明LC3Ⅰ转换为LC3Ⅱ，提示GMC可提高自噬通量。GMC浓度越高，LC3含量越高(P<0.01)，表明GMC可能通过增加自噬标记物LC3含量促进宫颈癌Hela细胞自噬，见图4。

图4 GMC对宫颈癌Hela细胞自噬的影响

2.5GMC激活AMPK信号通路 与对照组相比，处理组AMPK激活水平明显升高(P<0.01)，且呈剂量依赖性，加入AMPK抑制剂的各处理组AMPK激活水平明显低于细胞处理组。与AICAR组相比，GMC-H+AICAR组AMPK激活水平显著升高(P<0.01)，说明GMC通过激活AMPK信号通路调节细胞能量代谢，见图5。

图5 GMC对AMPK信号通路的影响

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，2015年27万宫颈癌死亡病例中，约90%发生在低收入和中等收入国家，是发达国家的18倍[13]。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的2种高危亚型几乎导致了所有宫颈癌，目前HPV筛查和疫苗接种是预防该疾病的有效策略。目前宫颈癌主要治疗手段为化学治疗，效果良好，但肿瘤复发和转移仍然是宫颈癌患者死亡的主要原因[14]。因此，研究宫颈癌发生发展过程、寻找新的治疗靶点已成为宫颈癌研究重点[15]。

本研究选用的天然化合物GMC是从传统中药姜黄根茎中提取的天然化学成分，具有抗病毒、抗炎、抗菌等药理作用[16]。药理研究发现，GMC具有明显的抗肿瘤作用，可抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞、胶质瘤细胞等肿瘤细胞生长，且低毒、高效[17，18]。GMC可降低人非小细胞肺癌NCI-H1770细胞增殖、侵袭及迁移,促进细胞凋亡[19]。GMC可促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖，且呈剂量依赖性，可单独或联合用于肝癌治疗和预防[8]。Liu等[20]研究发现GMC可通过抑制JAK2/STAT3信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡；Zhong等[7]研究发现GMC与阿霉素(MDR)具有协同作用，增强乳腺癌细胞增殖。GMC可调节胶质脑瘤细胞凋亡和G1期阻滞相关蛋白表达影响其增殖，与本实验结果一致[21]。本研究发现GMC可抑制宫颈癌Hela细胞凋亡。

自噬是细胞生理机制，具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用，自噬能力下降与宫颈癌发生密切相关[22,23]。研究表明，可通过诱导自噬降低HPV病毒载量，证明自噬可诱发癌症，也可抑制癌症[24]。因此，通过刺激自噬阻止损伤的发生并最终抑制肿瘤发生[25]。本研究发现，GMC可显著诱导自噬，表现为抑制Beclin 1和LC3-Ⅱ表达，促进P62表达，以剂量依赖方式促进细胞自噬。

AMPK是细胞能量传感器和营养通路激活的主要成分，可调节细胞增殖、生长和自噬[26]。肿瘤抑制基因LKB1可激活AMPK,而另一种肿瘤抑制基因TSC2 是AMPK的下游效应因子[27]。AMPK可作为宫颈癌治疗的潜在靶点。AMPK激活剂AICAR作为有效的抗肿瘤药物广泛应用于LKB1突变和缺失的癌症。Chen等[28]研究发现异丙酚通过抑制自噬通量抑制宫颈癌Hela细胞生长，其机制为激活AMPK和内质网应激。本研究结果表明，GMC作用于宫颈癌Hela细胞后可上调AMPK，但具体机制有待进一步研究。

本研究提示GMC可激活AMPK通路诱导宫颈癌Hela细胞自噬和凋亡。GMC可抑制宫颈癌Hela细胞增殖，促进其凋亡，促进自噬，提高LC3自噬标记物含量，可能通过激活AMPK信号通路实现。本研究结果可为GMC临床治疗宫颈癌提供依据。