大黄酚介导AMPK依赖性信号通路抑制结肠癌SW480细胞的增殖、侵袭和裸鼠体内肿瘤形成①

代继源 刘文杰 王春辉

(山东省昌邑市人民医院胃肠肛肠外科，昌邑 261300)

结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居胃肠道肿瘤发病率前三，且不断上升[1，2]。结肠癌治疗以降低复发率和提高存活率为主要目标，包括手术治疗、化学治疗和放射治疗等综合治疗手段。目前，多种植物提取物被用于结肠癌防治，在亚洲，大黄广泛用于发热、腹泻治疗，具有解毒功效，主要活性成分是蒽醌类化合物，其中大黄酚对许多肿瘤细胞活性均有抑制作用，可通过线粒体钙超载诱导卵巢癌细胞死亡、并抑制其侵袭性；通过调节ROS、AKT和ERK1/2信号通路诱导绒毛膜癌细胞凋亡，抑制大肠癌细胞缺氧诱导的上皮间充质转化等[3-6]。然而，大黄酚对人结肠癌SW480细胞的作用尚未阐明。本实验以人结肠癌SW480细胞株为研究对象，研究大黄酚对其体外增殖、侵袭和体内肿瘤形成的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料 人结肠癌细胞株SW480购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；SPF级裸鼠购自北京维通利华实验动物公司，本研究动物实验在我院动物伦理委员会批准下进行。RPMI1640培养液、FBS、0.25%胰蛋白酶、DMSO购自美国Gibco公司；注射用硫酸链霉素购自华北制药股份有限公司；注射用青霉素钠购自上海新先锋药业有限公司；RIPA裂解液、大黄酚(纯度≥98%)购自美国Sigma公司，大黄酚用DMSO和无血清培养基溶解配制；BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司；单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruze公司；免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Transwell小室购自北京优尼康生物技术有限公司；Matrix基质胶购自美国BD公司。

1.1.2仪器 恒温培养箱购自美国ThermoForma公司；PCR仪、电泳仪和半干转膜仪购自美国BIO-RAD公司；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司；低温离心机购自美国IEC公司；超净工作台购自苏州中亚净化设备有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将结肠癌细胞株SW480细胞悬浮于含10%FBS和1%青链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。镜下观察细胞生长状态，当细胞融合率达到80%以上时消化传代。用配好的培养基制成细胞悬液。

1.2.25-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)染色检测细胞增殖情况 接种第3代SW480细胞于96孔板，每孔加入2×104个/ml细胞悬液200 μl，待细胞贴壁后，用含0.4%FBS的培养液同步化孵育细胞72 h。将细胞分为4组，分别加入不同浓度大黄酚(终浓度分别为0、25、50、100 μmol/L)处理48 h，加入终浓度为0.03 μg/ml的Brdu，继续孵育40 min。弃培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞30 min。镜下随机选取3个视野观察并拍照。实验至少重复3次，每组6个复孔。Brdu阳性细胞呈绿色荧光，Brdu阳性细胞标记率=绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移能力 以1×105个/ml密度接种SW480细胞，待细胞贴壁后，用10 μl枪头垂直划痕，PBS洗去脱落细胞。将细胞随机分为4组，加入10 μg/ml丝裂霉素C并分别给予不同浓度大黄酚(终浓度分别为0、25、50、100 μmol/L)处理后继续培养24 h。于光学显微镜下随机选取5个视野观察并拍照，划痕闭合率 =(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.4Transwell实验检测细胞侵袭能力 提前用Matrigel基质胶包被Transwell小室上层，以1×105个/ml密度接种SW480细胞，培养液不加FBS，Transwell小室下层加入含FBS的细胞培养液。培养24 h后，用无菌棉签拭去Matrigel基质胶和小室上层细胞，PBS洗涤2次后，4%多聚甲醛固定小室，结晶紫染色迁移至小室下层的SW480细胞，流水冲洗后自然晾干。镜下随机选取3个视野计数染色细胞。实验重复3次，每组6个复孔。

1.2.5免疫荧光法检测大黄酚对波形蛋白(vimentin)表达的影响 细胞分组方法1.2.3，各组用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，轻轻去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室温染色5 min，轻轻吸去染液，PBS漂洗3次，镜下观察。

1.2.6免疫组织化学法检测移植瘤裸鼠肿瘤组织Ki67和VEGF表达情况 SPF级裸鼠无菌环境饲养，温度为26～28℃，湿度为50%～60%，光照10 h，自由采食和饮水，适应性饲养7 d后进行实验。取结肠癌SW480细胞并调整密度至2×107个/ml，于裸鼠颈部相同部位皮下注射上述细胞悬液0.2 ml以建立移植瘤裸鼠模型。次日，将模型动物随机分为4组，每组10只，分别1次/d腹腔注射PBS和12.5、25、50 mg/kg 大黄酚，每天给药1次，连续给药30 d。实验完成时摘取肿瘤并称重，制成约4 μm的石蜡切片，严格按照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，光学显微镜下观察Ki67和VEGF表达情况。

1.2.7Western blot检测增殖、上皮间充质转化和信号通路相关蛋白的表达 用含蛋白抑制剂的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解，提取各组细胞或肿瘤组织总蛋白，12 000 g 4℃离心10 min，取上清用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后，取等量蛋白凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭蛋白质2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。弃一抗，缓冲液清洗后加入对应二抗，室温孵育1 h。滴加电化学发光(ECL)显色液于暗室曝光显影，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1大黄酚对体外培养SW480细胞增殖能力的影响 Brdu染色结果显示，随着大黄酚浓度增加，绿色荧光逐渐减少，Brdu阳性细胞数量呈剂量依赖性减少(P<0.05或P<0.01)，见图1、2。免疫组织化学法和Western blot检测SW480细胞的增殖相关蛋白表达结果显示，体外培养的结肠癌SW480细胞高表达Ki67和PCNA蛋白；经不同浓度的大黄酚处理后，两者表达水平均呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01)，见图2、3。结果提示，大黄酚可呈剂量依赖性减弱SW480细胞的增殖能力。

图1 Brdu染色检测SW480细胞增殖能力Fig.1 Proliferation ability of SW480 cells were detected by Brdu staining

图2 大黄酚对SW480细胞增殖及增殖相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of chrysophanol on proliferation and expression of proliferation-related protein in SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

图3 Western blot检测SW480细胞增殖相关蛋白表达Fig.3 Expresions of proliferation-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

2.2大黄酚对体外培养SW480细胞迁移及侵袭能力的影响 划痕实验结果显示，与未经大黄酚处理组相比，各给药组细胞划痕闭合率均呈剂量依赖性减少(P<0.05或P<0.01)，见图4、5。Transwell实验结果显示，与未经大黄酚处理组相比，各给药组侵袭细胞数量明显减少，且大黄酚浓度越大，侵袭细胞数越少(P<0.05或P<0.01)，见图5、6。结果提示，大黄酚能呈剂量依赖性地降低SW480细胞迁移及侵袭能力。

图4 细胞划痕实验检测SW480细胞迁移情况Fig.4 Migration of SW480 cells was detected by scratch assay

图5 大黄酚对SW480细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.5 Effects of chrysophanol on migration and invasion of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

图6 Transwell实验检测SW480细胞侵袭能力Fig.6 Invasive ability of SW480 cells were detected by Transwell

2.3大黄酚对体外培养SW480细胞肿瘤上皮间充质转化(EMT)的影响 Western blot检测结果显示，与未经大黄酚处理组相比，各给药组迁移相关蛋白VEGF、间充质标记蛋白N-cadherin的表达水平显著降低，且与大黄酚给药浓度呈负相关；而上皮标记蛋白E-cadherin的表达水平呈大黄酚剂量依赖性上调(P<0.05或P<0.01)，见图7、8。免疫荧光法结果显示，与未经大黄酚处理组相比，各给药组SW480细胞内波形蛋白荧光量随大黄酚浓度增加而显著降低，即波形蛋白表达量呈大黄酚剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01)，见图8、9。因此，大黄酚能呈剂量依赖性地抑制体外培养SW480细胞转移能力。

图7 Western blto蛋白印迹法检测SW480细胞EMT相关蛋白表达Fig.7 Expresions of EMT-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

图8 大黄酚对SW480细胞上皮间充质转化的影响Fig.8 Effects of chrysophanol on EMT of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

图9 免疫荧光法检测Vimentin蛋白表达Fig.9 Expresion of Vimentin protein was detected by immunofluorescence

2.4大黄酚对体外培养SW480细胞信号通路的影响 Western blot结果显示，与未经大黄酚处理组相比，大黄酚给药组AMPKα1磷酸化水平均明显增强，且各组间差异具有统计学意义，与大黄酚浓度呈正相关(P<0.05或P<0.01)，见图10；各给药组P-mTOR/mTOR和cyclin D1的表达水平明显下降，与大黄酚浓度呈负相关(P<0.05或P<0.01)，见图10。提示大黄酚可促进SW480细胞AMPKα1磷酸化激活，而对mTOR和cyclin D1的表达则表现出明显抑制作用，且均呈剂量依赖性。

图10 大黄酚对SW480细胞信号通路的影响Fig.10 Effect of chrysophanol on signaling pathway of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

2.5大黄酚对结肠癌移植瘤小鼠肿瘤形成的影响 移植瘤小鼠存活率显示，与对照组相比，各给药组移植瘤小鼠存活率递减，见图11。各组移植瘤小鼠肿瘤重量显示，与对照组(0.45±0.09)g相比，各给药组移植瘤小鼠的肿瘤重量分别为(0.32±0.06)g、(0.24±0.07)g和(0.15±0.04)g，即随大黄酚剂量增加，肿瘤重量减小(P<0.05或P<0.01)。Western blot检测结果显示，与对照组相比，随大黄酚给药浓度增加，各给药组小鼠肿瘤组织中p-AMPK/AMPK表达水平显著上调，P-mTOR/mTOR和cyclin D1表达水平显著下调，且均与大黄酚剂量相关(P<0.05或P<0.01)，见图12、13。免疫组织化学结果显示，大黄酚给药浓度越大，肿瘤组织Ki67和VEGF阳性颗粒越少(P<0.05或P<0.01)，见图13、14，即大黄酚可抑制Ki67、VEGF表达。结果提示，大黄酚能剂量依赖性地促进AMPKα1激活、抑制mTOR和cyclin D1蛋白表达，从而抑制肿瘤在移植瘤小鼠体内的形成，降低移植瘤小鼠肿瘤组织重量，提高小鼠存活率。

图11 移植瘤小鼠存活率Fig.11 Survival rate of transplanted tumors in mice

图12 Western blot检测肿瘤组织中通路蛋白表达Fig.12 Expresions of pathway proteins in tumor tissue were detected by Western blot

图13 大黄酚对结肠癌移植瘤模型小鼠肿瘤形成的影响Fig.13 Effect of chrysophanol on tumorigenesis of colon cancer model miceNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol group (25 mg/kg),#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 mg/kg) group,△.P<0.05.

图14 免疫组化检测肿瘤组织中Ki67和VEGF表达情况Fig.14 Expresion of Ki67 and VEGF in tumor tissue were detected by immunohistochemical

3 讨论

结肠癌是三大恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和病死率，其发生与多种因素相关，包括细胞增殖、转移、凋亡、肿瘤微环境和自身免疫系统。中医药已广泛用于癌症治疗，作用于多种信号传导途径且不良反应较少[7]。大黄酚是中药大黄的有效成分之一，是蒽醌类化合物，具有多种生物学活性，如对绒毛膜癌、前列腺癌的抗肿瘤活性[4,8,9]。目前，关于大黄酚对人结肠癌SW480细胞增殖的作用尚未见报道。因此，本实验选取人结肠癌SW480细胞，探讨大黄酚对SW480细胞的影响及机制。

抑制肿瘤细胞增殖是抗癌药发挥作用的重要途径。研究表明，同为大黄提取物的大黄酸，对表皮生长因子受体(EGFR)过表达的SNU-C5人结肠癌细胞具有抗癌活性，通过抑制EGFR/mTOR信号通路阻断结肠癌细胞增殖发挥作用[10]。而大黄酚能抑制体外培养的乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞增殖，并诱导细胞凋亡，从而发挥抗乳腺癌作用[8]。本研究发现在体外培养的人结肠癌SW480细胞中，大黄酚可剂量依赖性地抑制增殖相关蛋白Ki67和KCNA表达，降低Brdu阳性细胞数，从而抑制肿瘤细胞增殖。

另外，抑制肿瘤细胞侵袭和转移是抗癌药的又一重要途径。研究表明，抑制肿瘤细胞中VEGF表达可有效抑制其增殖和转移，且VEGF家族及其受体可能是恶性肿瘤新的预后标志物[11-13]。决明子蒽酮-C-糖苷、决明子苷在结肠癌荷瘤小鼠体内的抗肿瘤和抗转移作用主要与抑制VEGF和MMP-9表达及VEGFR-2磷酸化等有关[14]。EMT是上皮细胞失去极性、获得间充质特性而增加转移和侵袭的过程，是肿瘤发生转移和侵袭的重要过程[15,16]。当发生EMT时，上皮标记蛋白E-cadherin明显下调，同时间充质标记波形蛋白表达上升[17]。本研究发现，大黄酚能抑制细胞侵袭，下调VEGF、N-cadherin及波形蛋白，上调E-cadherin蛋白表达，从而抑制体外培养SW480细胞的侵袭和转移。

AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)最是新发现的细胞内能量代谢的关键调节因子，通过感受细胞质内AMP/ATP比例变化调节新陈代谢，在应激过程中可抑制细胞增殖或提高细胞存活率，在癌症治疗和预防中的作用受到广泛关注[18,19]。体内外研究发现，AMPK的激活将抑制热休克因子-1(HSF1)活性，从而抑制胰腺癌细胞侵袭和转移[20]；肝激酶B1(LKB1)磷酸化激活AMPK，可负调控肿瘤细胞增殖和代谢，且LKB1/AMPK信号通路参与肿瘤侵袭和转移，是肿瘤向更高病理级别恶性进展的重要标志[21]。非甾体类抗炎药阿司匹林可通过AMPK-mTOR-Akt/ERK轴抑制肝癌HepG2细胞和结肠癌SW480细胞增殖并诱导其凋亡[18]。槲皮素(quercetin)则能通过调节Sestrin2-AMPK-mTOR信号通路提高细胞内ROS水平，从而诱导HCT116结肠癌细胞凋亡[22]。另外，细胞周期素D1 (cyclin D1)在许多恶性肿瘤细胞生长中发挥关键作用[23]。cyclin D1的转录激活可以抑制顺铂对小鼠胰腺癌细胞的杀伤作用，即cyclin D1表达下调可抑制肿瘤生长[24]。咖啡豆醇通过ERK1/2、JNK和GKS3β依赖性苏氨酸-286磷酸化诱导cyclin D1 蛋白酶体降解，从而抑制大肠癌HCT116、SW480细胞增殖[25]。大黄酚通过NF-κB/cyclin D1和NF-κB/Bcl-2信号通路级联抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[8]。本研究结果表明，大黄酚可浓度依赖性地抑制人结肠癌SW480细胞的体外增殖、侵袭和体内肿瘤形成，促进移植瘤小鼠存活，其作用机制与介导AMPK依赖性信号通路有关。

本研究认为，大黄酚能剂量依赖性地下调增殖相关蛋白Ki67和PCNA表达，通过影响AMPK信号通路相关蛋白表达影响SW480细胞增殖；还能通过影响E-cadherin、VEGF、N-cadherin和Vimentin表达水平调控SW480细胞EMT能力。另外，体内实验表明，大黄酚能促进荷瘤剂量组小鼠存活，降低肿瘤组织重量，影响Ki67、PCNA及AMPK信号通路蛋白表达，从而有效抑制肿瘤的体内形成。综上所述，大黄酚能介导AMPK依赖性信号通路抑制结肠癌SW480细胞的增殖、侵袭和体内肿瘤形成，其可作为结肠癌的治疗新型药物。