人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc融合蛋白的制备及鉴定

吴黎黎 贾健安 邵璇璇 黄保军

(安徽医科大学免疫教研室,合肥 230001)

Graves病(GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，促甲状腺激素受体抗体(TRAb)结合于促甲状腺激素受体(TSHR)，促进甲状腺滤泡上皮细胞增生，分泌过量甲状腺激素，引起甲状腺肿大和甲亢[1]。TRAb检测对于GD诊断及疗效监测具有重要意义[2-4]。TRAb含量极低，因此，其性质及其与TSHR的作用机制研究困难极大，基因工程技术获取重组单抗是解决这一问题的有效途径[5]。单链抗体(ScFv)分子量小、穿透力强，是特异性和亲和性最小的抗体功能片段，广泛用于基础医学研究、疾病体外诊断及疾病的临床治疗[6]。单链抗体与全抗体相比，ScFv稳定性较差且功能单一，而Fc端蛋白不但维持ScFv抗体功能和稳定其结构，还可方便抗体纯化。本研究构建了含有TRAb单链抗体与IgG1Fc序列的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc，运用Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达，并检测目的蛋白免疫学活性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种及细胞 大肠杆菌DH10Bac、Sf9细胞株和High FiveTM细胞株均购于美国Thermo公司。

1.1.2试剂 蛋白Marker、PureLinkTMHiPure质粒DNA小量提取试剂盒、胶回收试剂盒等均购于美国Thermo公司；SIM SF和SIM HF培养基购于北京义翘神州科技有限公司；dNTP购于美国promega公司；DNA marker购于北京天根生化科技有限公司；TRAb 化学发光检测试剂购于罗氏公司；SPA-Sepharose CL-4B亲和层析柱购于美国GE公司；氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、琼脂糖、琼脂粉、酵母提取物、IPTG和Bluo-gal等均购于Biosharp生物科技公司；即用型SABC-POD(人IgG)试剂盒购于博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1序列的合成和载体的构建 查阅人源化TRAb抗体的HV和LV序列[7]。以linker(G4S)连接，并于HV的5′端加上GP67信号肽序列;Genbank检索IgG1Fc段序列(AF150959),SnapGene软件分析上述基因序列和载体pFastBacTM1,优化并模拟构建载体，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，构建重组质粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc(图1A)。

1.2.2重组杆粒的生成 pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac，该细胞含有带mini-attTn7靶位点的杆状病毒穿梭载体(杆粒)和辅助质粒。载体pFastBacTM1上的mini-Tn7元件与DH10Bac上的mini-attTn7靶位之间发生转座反应，将目的基因插入杆状病毒基因组，生成重组杆粒(图1B)。蓝白斑筛选试验挑选阳性克隆；PureLinkTMHiPure质粒DNA小量提取试剂盒分离纯化重组杆粒DNA；pUC/M13正向和反向引物进行PCR验证和基因测序，引物序列为F:5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′。

图1 重组质粒构建图Fig.1 Construction map of recombinant plasmidNote:A.Construction map of pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc;B.Partial sequence of recombinant plasmid which will be into rod.

1.2.3杆状病毒储液的生成和扩增 27℃、无CO2条件下，SIM SF专用培养基培养Sf9昆虫细胞至对数期，且存活率大于95%，Cellfectin®Ⅱ试剂转染；倒置显微镜观察细胞，当细胞出现生长停滞、颗粒状外观或从培养板脱离时，收集上清(P1病毒储液，滴度约为5×106pfu/ml)，继续感染Sf9细胞，生成P2(滴度约为5×107pfu/ml)病毒储液，继续感染Sf9细胞，生成P3(滴度约为5×108pfu/ml)病毒储液。

1.2.4单链重组抗体TRAb的表达和分析 27℃、无CO2条件下，SIM HF专用培养基培养High FiveTM细胞至生长中期，密度为1×106个/ml时，用2 ml P3病毒储液于500 ml摇瓶内感染High FiveTM细胞，共感染5瓶，依次标记为1、2、3、4、5；24 h收集1号摇瓶培养上清100 ml，SPA-Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化,48 h收集2号摇瓶培养上清100 ml，纯化；72 h收集3号摇瓶，96 h收集4号摇瓶，120 h收集5号摇瓶,得到大量含有可溶性单链抗体ScFv-IgG1Fc的上清，SPA-Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化；纯化后的抗体分别用BCA试剂盒检测其抗体表达。收集的72 h上清纯化后行SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度，化学发光法和免疫组化检测抗体活性。

1.2.5免疫组化检测目的蛋白与甲状腺组织TSHR结合力 目的蛋白作为一抗，其ScFv部分与人正常甲状腺组织上的TSHR结合，生物素标记的兔抗人IgG作为二抗与目的蛋白的IgG1 Fc段结合，SABC放大系统和DAB显色系统于光学显微镜OlympusBX43下观察。

2 结果

2.1重组杆粒的PCR鉴定 3 000 bp和5 000 bp约检测出3 747 bp条带，符合理论预测(2 300 bp+1 447 bp)，测序结果显示目的基因构建正确(图2)。

图2 重组杆粒的PCR验证Fig.2 PCR identification of recombinant baculovirusNote:M.Trans2K plus DNA marker;1,2,3.PCR products which were amplified by forward and reverse primers.

2.2可溶性单链抗体融合蛋白BCA浓度检测和SDS-PAGE的鉴定 随培养时间的增加，目的蛋白表达增加(图3A)。72 h表达与48 h表达差异显著(P<0.01)，96 h表达与72 h表达差异无统计学意义(P>0.05),说明目的蛋白于72 h表达量最高，纯化后的抗体浓度为1.746 mg/ml。72 h目的蛋白出现于55 kD附近，无杂带，纯度较高(图3B)。

图3 目的蛋白的BCA和SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达Fig.3 Detection of expressions of target protein by BCA and SDS-PAGENote:M.Protein marker;1.Purified antibody.

2.3单链抗体融合蛋白ScFv-IgG1Fc免疫活性检测 目的蛋白的ScFv部分竞争性抑制化学发光物质标记的TRAb与TSHR结合，导致光电信号减弱。目的抗体原滴度均大于检测上限(40 U/L)，故稀释20倍后检测，相对荧光单位(RLU)和换算后的抗体活性浓度证实单链抗体融合蛋白与TSHR有较高的亲和力(图4)。

图4 ECLIA检测抗体活性浓度Fig.4 Antibody activity concentration detected by ECLIANote:Compared with Negative control,**.P<0.01.

2.4目的蛋白与TSHR结合力结果显示甲状腺滤泡上皮细胞周围呈现出棕黄色，提示目的蛋白与TSHR具有较高结合力(图5)。

图5 免疫组化检测目的蛋白结合力(×400)Fig.5 Binding force of target protein detected by IHCT(×400)Note:A.PBS insteading of primary antibody as negative contrast;B.Positive expression of target protein insteading of primary antibody.

3 讨论

TRAb在Graves病和甲状腺相关性眼病(TAO)的发病中起重要作用，但具体机制尚不明确[8,9]。孕妇体内高浓度的TRAb可穿过胎盘屏障影响胎儿发育[10]。因此，阐明TRAb结构和作用机制可为临床诊断和治疗提供依据。

单克隆抗体具有较高的灵敏度和特异性，广泛用于疾病临床诊断、治疗、预防和蛋白质提纯。国外先后制备了鼠源性TRAb，但在人循环系统的半衰期较短，易被人免疫系统识别，多次使用易产生人抗鼠抗体(HAMA)[11，12]。Sanders等[13]于2003年获得了目前应用最广泛的人源性刺激性的TRAb抗体(M22)。Smith等[14]于2004年报道以M22-生物素为基础的检测TRAb的ELISA技术，具有较高灵敏度和特异性。罗氏公司开发了以M22为主要反应试剂的检测TRAb的电化学发光免疫分析法,简便快捷，临床应用较为广泛。Sanders等[13]获得的人源性单克隆抗体由EB病毒淋巴永生化标准技术分离和克隆分泌性杂交瘤技术制成，但传统的杂交瘤技术制备周期较长、成本较高、所获得细胞不稳定。单链抗体作为小型改造抗体保留了抗原的亲和活性，分子量小、副作用低，旦生产成本低、易于规模化生产，应用前景广泛。

本实验运用Bac-to-Bac表达系统实现了人源化的TRAb单链抗体融合蛋白的高效表达，比同源重组杆粒表达缩短了2周。在构建重组载体的基础上，运用SnapGene软件对质粒载体pFastBacTM1、带有GP67信号肽的ScFv序列、IgG1Fc段序列进行分析、优化和模拟重组质粒的构建，以基因合成的方式构建重组质粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc。G4S linker是刚性结构重复出现的4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的15肽序列，可拉紧VH和VL，且不影响VH、VL的自由折叠和分子动力学的改变；GP67信号肽帮助剪辑成熟的目的蛋白穿膜分泌至胞外。本实验获得的抗体蛋白为人源化单链抗体融合蛋白，具有较高抗原亲和力。人源化抗体具有更加优越的临床疗效和最低的免疫原性[15]。报道表明TRAb属于异质性抗体，分为刺激性抗体(TSAb)、阻断性抗体(TBAb)和中性抗体[16]。TSAb与TSHR结合后，刺激甲状腺细胞的增殖和激素的分泌，诱发甲状腺功能亢进；TBAb与TSHR结合后，阻断TSH与TSHR的结合，诱发甲状腺功能减退，而TSAb在Graves病中占主导地位。因此，本实验室选择性表达TSAb，可用于Graves病的诊断和疗效观察，或用于TRAb与TSHR结合的生物学研究，为自身免疫性甲状腺疾病的免疫治疗奠定基础。