参菊洗剂抗炎作用机制的研究

张广求， 张美祥， 谭 璐

(黄冈市中心医院药剂科； 长江大学黄冈临床医学院， 湖北 黄冈 438000)

参菊洗剂是黄冈市中心医院根据临床验方研制的中药外用洗剂，主要由苦参、野菊花、黄柏、蛇床子等中药组成，具有清热解毒、祛风除湿、杀虫止痒功效，用于湿毒所致的细菌性、真菌性、滴虫性阴道炎及皮肤瘙痒症的治疗，具有较好的临床疗效[1-2]。本课题组前期对参菊洗剂的体外抑菌、抗过敏、杀虫止痒作用及皮肤刺激性、急性毒性等进行了研究[3-6]。 本研究采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀3种炎症模型，探究参菊洗剂的抗炎作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药参菊洗剂(含生药量为0.54 g/mL，黄冈市中心医院药剂科自制，批准文号：鄂药制字Z20180800，批号：180328，180415，180502)，洁尔阴洗液(含生药量为1 g/mL，四川恩威制药有限公司，批号：1704003)，0.9%氯化钠注射液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，批号：170401-0504)，硫化钠(天津大茂化学试剂厂，批号：201700916)，乙醚(天津市天力化学试剂有限公司，批号：20180322)，二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160216)，伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150729)，冰醋酸(广州市番禺力强化工厂，批号：20170615)，角叉菜胶(美国SIGMA公司，批号：SLBK3896V)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180322)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20180328)，前列腺素E2(PGE2)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：20180519)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：20180428)。

1.2 仪器ZH-YLS-Q4型鼠耳打孔器(原阳县振华教学仪器有限公司)，YLS-7B型足跖容积测量仪(济南益延科技发展有限公司)，AL104型电子天平[梅特勒托利多仪器(上海)有限公司]，Allegra 64R型高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)，FSH-2A型可调高速匀浆机(江苏省金坛市医疗仪器厂)，TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，T6型新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，Multiskan FC型酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司]，HS-80TW-1DF型电子秒表(深圳市博迅达电子科技有限公司)。

1.3 实验动物KM小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(20±2)g，购买于三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2017-0012。SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(200±20) g，购买于湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。所有动物均自由摄食和饮水，在室温度(20～26)℃，相对湿度40%～70%的环境中适应性饲养5～7 d。动物使用许可证号：SYXK(鄂)2014-0083。本实验方案及操作均符合医学动物实验伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验[7]取小鼠50只，雌雄各半，用乙醚麻醉，分别在小鼠右耳廓前后两面均匀涂布20 μL二甲苯，致炎后随机分为5组：参菊洗剂低、中、高剂量组(参菊洗剂0.054、0.108、0.216 g/mL)，阳性对照组(10%洁尔阴洗液，0.1 g/mL)，模型对照组(0.9%氯化钠注射液)，每组10只。另取小鼠10只，雌雄各半，不进行任何处理作为空白对照组。在致炎后0.5、1.0、2.0 h分别在各组小鼠右耳廓炎症部位涂抹相应药物，每次50 μL，各组小鼠左耳不作任何处理。致炎4 h后用乙醚浅表麻醉小鼠，颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用鼠耳打孔器于左、右耳相同部位取下圆形耳片，用电子天平称取质量，以同一只小鼠两耳片质量差为肿胀度，计算各组小鼠耳肿胀度和肿胀抑制率，耳肿胀度=右耳片质量/mg-左耳片质量/mg；肿胀抑制率/%=[(模型对照组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/模型对照组肿胀度均值]×100%。

1.4.2 抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性实验[8]取小鼠50只，雌雄各半，每只小鼠腹部同一部位各脱毛2 cm×3 cm，随机分为5组，每组10只,分别为：参菊洗剂低、中、高剂量组(参菊洗剂0.054、0.108、0.216 g/mL)，阳性对照组(10%洁尔阴洗液，0.1 g/mL)，模型对照组(0.9%氯化钠注射液)。脱毛24 h后，分别在各组小鼠脱毛区均匀涂抹相应药物，每次0.1 mL，每天2次，连续3 d。末次给药30 min后，于小鼠尾静脉注射含0.5%伊文思蓝的0.9%氯化钠注射液0.2 mL，腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 mL致炎，20 min后，用乙醚浅表麻醉小鼠，颈椎脱臼处死，腹腔注射0.9%氯化钠注射液6 mL，反复轻柔腹部20次，吸出腹腔液于3 000 r/min (r=10 cm)离心5 min，取上清液，用分光光度计测定590 nm处的吸光度，计算腹腔毛细血管通透性抑制率。腹腔毛细血管通透性抑制率/%= [(模型对照组平均吸光度-给药组平均吸光度)/模型对照组平均吸光度]×100%。

1.4.3 抗角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验[9]取后肢足跖正常无损伤的大鼠50只，雌雄各半，将大鼠右后下肢外侧脱毛处理，分别测定右后足跖体积，作为致炎前的足跖体积。将大鼠随机分为5组，每组10只，分别为：参菊洗剂低、中、高剂量组(参菊洗剂0.054、0.108、0.216 g/mL)，阳性对照组(10%洁尔阴洗液，0.1 g/mL)，模型对照组(0.9%氯化钠注射液)。将各组大鼠右后足跖分别置于相应药液中浸泡180 s，各组大鼠分别于1、2 h后右后足跖中部皮下注射1%角叉菜胶混悬液(用0.9%氯化钠注射液配制)0.1 mL致炎，测量各组大鼠致炎后1、2、3、4 h时右后足跖体积。以大鼠致炎前、后足跖体积的差值为肿胀度，比较各组大鼠足跖肿胀度的差异，肿胀度/mL=致炎后足跖体积-致炎前足跖体积。

1.4.4 对炎症大鼠血清和足跖组织中SOD、MDA、PGE2、TNF-α的影响 将“1.4.3”项下测量给药后4 h足跖体积的大鼠用乙醚麻醉，摘眼球取血，颈椎脱臼处死。全血静置30 min后，3 000 r/min (r=10 cm)离心10 min，取上层血清，置于4℃冰箱中冷藏，备用。按照试剂盒说明书操作，分别测定血清中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。在踝关节处剪下各组大鼠右后足跖，称定质量后剪碎，以4℃预冷的0.9%氯化钠注射液制成10%组织匀浆，4℃下3 000 r/min (r=10 cm)离心10 min，取上清液，置于4℃冰箱中冷藏，备用。按照试剂盒说明书操作，分别测定足跖组织中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。

2 结果

2.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀抑制率的影响与模型对照组比较，参菊洗剂各剂量和阳性对照组小鼠肿胀抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。与阳性对照组比较，菊洗剂高剂量组小鼠肿胀抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 参菊洗剂对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

2.2 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响与模型对照组比较，参菊洗剂各剂量和阳性对照组小鼠腹腔毛细血管通透性抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。与阳性对照组比较，菊洗剂高剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 参菊洗剂对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

2.3 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响与模型对照组比较，参菊洗剂各剂量和阳性对照组大鼠在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖肿胀度均降低，差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。与阳性对照组比较，参菊洗剂高剂量组在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖肿胀度降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 参菊洗剂对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

2.4 对炎症大鼠血清和足跖组织中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影响与模型对照组比较，参菊洗剂各剂量和阳性对照组大鼠血清中SOD水平升高，MDA和TNF-α水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。与阳性对照组比较，参菊洗剂中、高剂量组大鼠血清中SOD水平升高，参菊洗剂高剂量组大鼠血清中MDA和TNF-α水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表4。与模型对照组比较，参菊洗剂各剂量和阳性对照组大鼠足跖组织中SOD水平升高，MDA、PGE2和TNF-α水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。与阳性对照组比较，参菊洗剂中、高剂量组大鼠足跖组织中SOD水平升高，参菊洗剂高剂量组大鼠足跖组织中MDA和TNF-α水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表5。

表4 参菊洗剂对大鼠血清中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影响

表5 参菊洗剂对大鼠足跖组织中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影响

3 讨论

炎症是临床较常见的病理生理过程，是机体对有害刺激所产生的复杂的防御反应，在该过程中，巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎症细胞释放的PGE2、TNF-α等多种炎症因子都有参与。炎症的发展一般分为早、中、晚三期，急性炎症或炎症早期的主要表现是毛细血管扩张、通透性增加、渗出和水肿，中期表现为血小板吸附及白细胞游走，晚期为肉芽组织增生[10]。SOD是生物体内重要的内源性活性蛋白酶，能催化超氧化物自由基分解，清除氧自由基，抑制脂质过氧化，对抗氧化应激反应和抑制炎症细胞因子的产生引起的炎症反应，保护细胞、组织免受氧化损伤，有效抵抗氧自由基对机体的伤害[11-12]。炎症细胞产生的氧自由基，攻击细胞膜、线粒体膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，形成过氧化脂质，进一步分解为MDA。测定MDA的水平，可反映机体脂质过氧化的程度及细胞受自由基攻击的程度[13]。PGE2是花生四烯酸的代谢产物，是一种活性很强的炎症因子，具有扩张血管、致热、致痛等生物活性，可通过加强组胺及缓激肽的效应而引起血管通透性增强、加强其他趋化因子的作用而使白细胞向炎区聚集，从而引起水肿、充血、局部红斑等炎症反应。本研究表明，参菊洗剂能明显降低大鼠足跖炎症组织中PGE2含量，但各组大鼠血清PGE2含量均未有显著变化。可能是由于血清PGE2主要来源于血管内皮细胞和血小板，在炎症反应过程中未受到明显刺激，故血清PGE2的含量就没有明显变化；而足跖炎症组织因致炎物质角叉菜胶的刺激使PGE2合成增多。因此，抗炎药能抑制局部组织中PGE2合成发挥抗炎作用，而对血清中PGE2含量无明显影响[14]。TNF-α是炎症反应的重要调节因子，通过诱导自身免疫反应，特别是T细胞和巨噬细胞的活化，促进炎症反应和组织损伤；同时，诱导机体产生急性时相反应蛋白，作用于血管内皮细胞，使之分泌趋化性细胞因子，从而趋化单核细胞及中性粒细胞，并刺激其活化，释放出多种炎症因子，引起炎症反应[15]。

本研究发现，参菊洗剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸致小鼠毛细血管通透性增加和角叉菜胶致大鼠足跖肿胀均有良好的抑制作用，其抗炎机制与提高SOD活性，增强清除自由基能力，抑制脂质体过氧化和MDA、PGE2、TNF-α等炎症因子的合成与释放有关。证实参菊洗剂外用具有较好的抗炎作用，为其临床应用提供了科学依据。