血站实验室溶血、脂血比色卡的建立及探讨

韩晓燕，冯 旭，许苗苗，张麦利，李 敏

陕西省渭南市中心血站检验科，陕西渭南 714000

溶血、脂血是血站实验室最常见的标本状态，有文献报道轻中度溶血、脂血标本对ALT[1]、乙型肝炎病毒表面抗原[2-3]、丙型肝炎病毒抗体[4]、人类免疫缺陷病毒抗原抗体[5]、核酸检测[6]等项目的检测结果均无影响，重度溶血、脂血标本可导致人类免疫缺陷病毒抗体[5]、梅毒螺旋体抗体[7]的检测出现假阳性；但不同水平梯度溶血、脂血标本影响血站实验室开展项目的系统性研究鲜见报道。本实验室基于：(1)核酸检测具有灵敏度高、抗干扰能力弱等特点[8-9]；(2)核酸标本接收时已离心，目测检查的可操作性强；(3)ELISA检测至少有一次洗板过程，溶血、脂血标本已被洗去，不会影响结果读取[2,10]等原因，选择核酸检测项目来验证溶血、脂血标本对血站实验室检测项目的影响情况，并依据该情况制作溶血、脂血目测比色卡，作为标本接收时的依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 50 IU/mL HBV DNA(批号：201909008)、200 IU/mL HCV RNA(批号：201907007)、1 000 IU/mL HIV-1 RNA(批号：201908007)和阴性质控品(批号：201907006)均购于北京康彻思坦生物技术有限公司；中链三酰甘油(批号：16308LNLCL，原产国：印度尼西亚)；溶血标本(自制)，核酸检测阴性的无偿献血者血浆。

1.2试剂、仪器与耗材

1.2.1核酸检测试剂 Roche TaqScreen MPX Test version 2.0试剂(批号：E31914)，所用试剂严格按照试剂说明书要求进行操作。

1.2.2仪器与耗材 瑞士Roche Cobas s201全自动核酸检测系统，包括Hamilton Microlab Star全自动混样仪，Cobas Amplipre核酸提取仪及Cobas Taqman核酸扩增仪；旋涡混合器(江苏康健医疗用品，型号：XH-B型)；血球计数仪(希森美康，型号：KX-21)；生物安全柜(苏净安泰，BHC-1300)；可调式移液器(北京大龙，型号：100～1 000 μL)；核酸负压管(碧迪医疗器械，批号：9184731)。

1.3方法

1.3.1溶血、脂血及阳性项目浓度的选择 依据《临床实验室标本溶血检测与应用专家共识(征求意见稿)》、Cobas TaqScreen MPX V2.0 试剂说明书及《血站技术操作规程》(2019版)中溶血、脂血程度对核酸检测结果的影响情况，选择验证的溶血标本中血红蛋白水平分别为0、50、150、250、500 mg/dL，脂血标本中三酰甘油水平分别为0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL；选择验证的HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的水平均为3倍最低检出限(LOD)水平，分别为6.9、20.4 IU/mL 和150.9 IU/mL。溶血标本选择16例，脂血标本选择15例。

1.3.26 000 mg/dL三酰甘油溶液的配制 96 000 mg/dL的三酰甘油原液加核酸检测阴性的无偿献血者混合血浆分两次做4倍稀释，阴性混合血浆旋涡震荡3 min，稀释后的三酰甘油溶液旋涡震荡至少10 min(0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL 5个水平梯度的脂血标本均用6 000 mg/dL三酰甘油溶液配置)。

1.3.3溶血标本原液的准备 核酸检测阴性的无偿献血者混合血浆加ELISA检测阴性的红细胞于-20 ℃冰箱反复冻融后，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用血球计数仪测2次血红蛋白，取均值，实验中所得溶血标本原液血红蛋白水平为900 mg/dL。

1.3.4不同水平溶血、脂血及3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA混合标本的配制 用阴性血浆分别将 6 000 mg/dL三酰甘油溶液(900 mg/dL溶血标本原液)和50 IU/mL的HBV DNA、200 IU/mL的HCV RNA、1 000 IU/mL的HIV RNA稀释成三酰甘油水平分别为0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL(游离血红蛋白水平分别为0、50、150、250、500 mg/dL)及3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA混合标本。

1.3.5检测方法 采用Pools of 1模式单检，每个标本单检加样量为1 000 μL。

1.4结果判读标准

1.4.1试验结果的判读规则 试剂盒阴阳对照、IC均有效，该批试验结果方可接受。

1.4.2溶血、脂血目测比色卡对检测结果的判读要求 不同游离血红蛋白水平的溶血标本、不同三酰甘油水平的脂血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 3个项目均能检出，该水平的溶血、脂血标本方可接受。

2 结 果

2.1溶血标本对核酸检测项目检出率的影响情况 游离血红蛋白水平分别为0、50、150、250、500 mg/dL 的溶血标本对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA项目的检出率均没有影响(P>0.05)，见表1。

表1 不同水平梯度溶血对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA检出率的影响

2.2不同水平梯度溶血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA Ct值的比较情况 不同水平溶血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 项目的Ct值与正常组(0 mg/dL组)标本中的Ct值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同水平梯度溶血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA Ct值的比较

2.3脂血标本对核酸检测项目检出率的影响情况 三酰甘油水平为0、800、1 700、2 500 mg/dL 时对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的检出率均没有影响(P>0.05)；3 300 mg/dL脂血标本对HBV DNA、HCV RNA两个项目的检出率无影响(P>0.05)，但对HIV RNA的检出率有影响(P<0.05)，见表3。

表3 不同水平梯度脂血对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA检出率的影响

2.4不同水平梯度脂血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 的Ct值比较情况 除3 300 mg/dL水平脂血标本中3倍HIV RNA的Ct值外，其他不同水平三酰甘油的脂血标本组中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的Ct值与正常标本(0 mg/dL组)中的Ct值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同水平梯度脂血标本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的Ct值比较

2.53 300mg/dL 水平脂血对3倍LOD HIV RNA检出率影响的补充试验 针对结果2.3中，15例3 300 mg/dL脂血标本中有1例HIV RNA未检出的情况，继续补充10例标本，以验证3 300 mg/dL脂血对HIV RNA项目的影响。配制方法：用阴性血浆将 6 000 mg/dL三酰甘油溶液和1 000 IU/mL的HIV RNA质控品稀释成三酰甘油水平为3 300 mg/dL的3倍LOD HIV RNA混合标本。采用Pools of 1模式单检，10例3 300 mg/dL 水平脂血标本中3倍LOD HIV RNA的检出率为80%(8/10)，Ct值为36.85±1.14。

2.6目测比色卡 溶血标本目测比色卡见图1；脂血标本目测比色卡见图2。

图1 溶血标本目测比色卡

3 讨 论

标本采集作为血站实验室检测前的重要环节，是血液检测质量保证的第一道关卡，标本的状态及质量直接决定后续检测结果的准确性，故血站实验室应建立适宜本实验室的溶血、脂血目测比色卡，以避免不合格溶血、脂血标本进入血液检测过程，进而确保血液核酸检测结果准确，保障临床用血安全。

表1显示当标本中血红蛋白水平分别为0、50、150、250、500 mg/dL 时对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA项目的检出率均没有影响；表2中血红蛋白为50、150、250、500 mg/dL的溶血标本组中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA项目的Ct值与正常标本(0 mg/dL组)中的Ct值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Cobas TaqScreen MPX V2.0 试剂盒说明书中显示血红蛋白最高达500 mg/dL时对检测结果无影响，本次实验设定的不同水平血红蛋白的溶血标本对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的检测结果符合Cobas TaqScreen MPX V2.0 试剂盒说明书要求。

表3显示标本中三酰甘油水平分别为0、800、1 700、2 500 mg/dL 时对3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA项目的检出率均没有影响；3 300 mg/dL水平脂血标本对HBV DNA、HCV RNA两个项目的检出率无影响，但对HIV RNA的检出率有影响。表4中除3 300 mg/dL水平脂血标本中3倍LOD HIV RNA的Ct值组外，其他不同水平三酰甘油的脂血标本组中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA项目的Ct值与正常标本(0 mg/dL组)中的Ct值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。表3和3 300 mg/dL水平脂血标本对3倍LOD HIV RNA检出率影响的补充试验中，3 300 mg/dL水平脂血且3倍LOD HIV RNA阳性标本的测试数共25例，其中检出HIV RNA阳性22例，总检出率为88%(22/25)，小于95%的置信区间，并结合本研究1.4.2的要求，判定三酰甘油水平为3 300 mg/dL的脂血标本对HIV RNA的检出率有影响，该情况与Cobas TaqScreen MPX V2.0 试剂盒说明书中三酰甘油水平最高达3 300 mg/dL时对检测结果无影响的内容不符合，分析原因可能有：(1)商品化的三酰甘油溶液不能百分百模拟人源性的脂血，导致检测结果有差异；(2)本试验方案测试数较少，不能代表试剂盒测试过程的实际状态；(3)3 300 mg/dL三酰甘油的脂血标本在本实验室环境中用Cobas TaqScreen MPX V2.0 试剂盒检测时，对HIV RNA的检出率确实有影响。

陈雪等[11]研究中血红蛋白水平为682 mg/L(68.2 mg/dL)、三酰甘油水平为15 009.6 mg/L(1 500.96 mg/dL)不会影响 HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的检测结果；张龙穆等[12]报道中度、重度脂血不会导致核酸检测结果出现假阳性或假阴性；张翠莉等[13]研究中溶血和脂血对实时荧光定量PCR检测HBV DNA结果无影响。本研究的结论与上述研究结果并不完全一致，可能与不同研究中血红蛋白、三酰甘油设定的水平梯度、检测分析方法及检测系统不同等因素有关，所以需建立适合本实验室环境、检测系统、分析方法的溶血、脂血比色卡。

溶血标本目测比色卡(图1)中不同溶血程度目测观察较明显，易于操作；脂血标本目测比色卡(图2)中800、1 700、2 500、3 300 mg/dL 脂血程度目测观察区别不显著，可能与使用商品化三酰甘油原液配制所得相关，所以实际操作中，标本接收人员应仔细甄别，对于明显高于或与3 300 mg/dL 水平相当的脂血标本，在保证标本和献血者溯源性的前提下，可重新采样，若两次采样标本均为同等脂血标本，则拒绝接收；对于接近2 500～3 300 mg/dL 水平的脂血标本，可做特殊标识，试验前采取高速离心后去除上层脂浆的措施[14]保证检测结果的准确性。

笔者在本次溶血、脂血比色卡建立过程中有以下几方面的建议和思考：(1)以核酸检测结果建立的溶血、脂血比色卡是否适合于血型检测，还有待进一步确认；(2)溶血标本的制备尽量在实验前2～3 d开始，不宜过早准备，避免冻融的过程中滋生细菌，影响结果的准确性；(3)溶血标本反复冻融后，离心吸取上清时避免晃动，减少细胞碎片对检测结果的影响；(4)有条件的实验室可收集临床脂血标本做比色卡验证，若必须要用商品化三酰甘油，则配制过程中旋涡震荡混匀环节必须超过10 min，使配制溶液充分混匀，且混匀后立即上机检测；(5)脂血比色卡实验全过程中实验室温度应保持25 ℃左右，不得低于20 ℃，防止脂肪层析出影响检测结果；(6)标本管的贴签应不占满管体，方便接收人员查看标本采集量及标本状态。